スーパーシグナルペプチドの開発と有用タンパク質の分泌生産への応用

• 研究課題/領域番号: 02558018
• 研究種目: 試験研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 代謝生物化学
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 水島 昭二 東京大学, 応用微生物研究所, 教授 (50013313)
• 研究分担者: 松山 伸一 東京大学, 応用微生物研究所, 助手 (50183108) ; 疋田 千波 東京大学, 応用微生物研究所, 特別研究員 (60222238)
• 研究期間 (年度): 1990 – 1992
• 研究課題ステータス: 完了 (1992年度)
• 配分額: 12,600千円 (直接経費: 12,600千円); 1992年度: 4,200千円 (直接経費: 4,200千円); 1991年度: 4,000千円 (直接経費: 4,000千円); 1990年度: 4,400千円 (直接経費: 4,400千円)
• キーワード: タンパク質の分泌 / シグナルペプチド / スーパーシグナルペプチド / シグナルペプチド正荷電域 / シグナルペプチド疎水域 / 人工シグナルペプチド / 大腸菌 / タンパク質の膜透過 / ス-パ-シグナルペプチド

研究概要

モデルタンパク質RroOmpF-Lppの誘導体を用いて以下の研究成果を挙げた。
1.シグナルペプチドの中央疎水領域の役割:〔Leu〕n系列を用いて、全疎水性が強くなると、膜酸性リン脂質要求性が弱くなること、また酸性リン脂質と強く結合する薬剤(Doxorubicin,Polylysine)による膜透過能の阻害が見られることを明らかにした。
2.中央疎水領域とN末端正荷電領域の機能の関連性:〔AlaLeu〕n系列においても、疎水度が高くなるとN末端正荷電要求性が低くなることを明らかにした。N末端正荷電がないと高濃度のSecAを要求すること、それは正荷電がSecAに対する分泌型タンパク質の高い親和性に関与しているためであることも明らかにした。またこれらの研究より、タンパク質の膜透過では、まず細胞質中のSecAが分泌型タンパク質を認識し、しかる後に膜上の分泌装置へと運搬するとの機構が強く示唆された。
3.C末端領域の構造と機能の関連性:C末端領域についての直接の情報は得られなかったが、C末端に続く成熟型N末端のコンホメーションが細胞質膜透過とともに、外膜透過にも重要な役割を果していることを明らかにすることができた。
4.In vitro実験系を用いての解析:疎水領域が長くなるとN末端正荷電がなくても膜透過しうることを、in vitroでも示すことができた。一方、応用上注目すべきシグナルペプチドを作成するまでには至らなかった。

研究成果

• [文献書誌] M.Kato et al.: "In vitro translocation of secretory proteins possessing no charges at the mature domain takes place efficiently in a protonmotive force-dependent manner." J.Biol.Chem.267. 413-418 (1992)
• [文献書誌] L.Bruncage et al.: "SecY,SecE and band 1 form the membrane-embedded domain of E.coli preprotein translocase." J.Biol.Chem.267. 4166-4170 (1992)
• [文献書誌] C.Hikita.et al.: "Effects of total-hydrophobicity and length of the hydrophobic domain of a signal peptide on in vitro translocation efficiency." J.Biol.Chem.267. 4882-4888 (1992)
• [文献書誌] K.Nishiyama et al.: "The C-terminal region of SecE interacts with SecY and is functional in the reconstitution of protein translocation activity in Escherichia coli." J.Biol.Chem.267. 7170-7176 (1992)
• [文献書誌] S.Matsuyama et al.: "Overproduction,purification and characterization of SecD and SecF,integral membrane components of the protein translocation machinery of Escherichia coli." Biochim.Biophys.Acta. 1122. 77-84 (1992)
• [文献書誌] C.Hikita et al.: "The requirement of a positive charge at the amino terminus can be compensated for by a longer central hydrophobic stretch in the functioning of signal peptides." J.Biol.Chem.267. 12375-12379 (1992)
• [文献書誌] H.Takamatsu et al.: "In vivo and in vitro characterization of the SecA gene product of bacillus subtilis." J.Bacteriol.174. 4308-4316 (1992)
• [文献書誌] S.Matsuyama et al.: "Large-scale production of membrane proteins fused to a truncated SecA in Escherichia coli." Biosci.Biotech.Biochem.56. 1512-1514 (1992)
• [文献書誌] S.Matsuyama et al.: "SecD is involved in the release of translocated secretory proteins from the cytoplasmic membrane of Escherichia coli." EMBO J.12. 265-270 (1993)
• [文献書誌] Shoji Mizushima: "In vitro biochemical studies on translocation of presecretory proteins across the cytoplasmic membrane of Escherichia coli." Methods in Cell Biol.34. 107-146 (1991)
• [文献書誌] Chinami Hikita: "Effects of total-hydrophobicity and length of the hydrophobic domain of a signal peptide on in vitro translocation efficiency." J.Biol.Chem.(1992)
• [文献書誌] Chinami Hikita: "The requirement of a positive charge at the amino-terminus can be compensated for by a longer central hydrophobic stretch in the functioning of signal paptides." J.Biol.Chem.(1992)
• [文献書誌] Sasaki,S.,Matsuyama,S.and Mizushima,S.: "<In>___ー <vitro>___ー Kinetic analysis of the role of the positive charge at the aminoーterminal region of signal peptides in translocation of secretory protein across the cytoplasmic membrane in <Escherichia>___ー <coli.>___ー" J.Biol.Chem.265. 4358-4363 (1990)
• [文献書誌] Matsuyama,S.,Kimura,E.and Mizushima,S.: "Complementation of two overlapping fragments of SecA,a protein translocation ATPase of <Escherichia>___ー <coli>___ー,allows ATP binding to its aminoーterminal region." J.Biol.Chem.265. 8760-8765 (1990)
• [文献書誌] Akita,M.,Sasaki,S.,Matsuyama,S.and Mizushima,S.: "SecA interacts with secretory proteins by recognizing the positive charge at the aminoーterminus of the signal peptide in <Escherichia>___ー <coli>___ー." J.Biol.Chem.265. 8164-8169 (1990)
• [文献書誌] Tokuda,H.,Kim,Y.J.and Mizushima,S.: "<In>___ー <vitro>___ー protein translocation into inverted membrane vesicles prepared from <Vibrio>___ー <alginolyticus>___ー is stimulated by the electrochemical potential of Na^+ in the presence of <Escherichia>___ー <coli>___ー SecA." FEBS Letters. 264. 10-12 (1990)
• [文献書誌] Mizushima,S.and Tokuda,H.: "<In>___ー <vitro>___ー translocation of bacterial secretory proteins and energy requirements." J.Bioenerg.Biomemb.22. 389-399 (1990)
• [文献書誌] Matsuyama,S.,Akimaru,J.and Mizushima,S.: "SecEーdependent overproduction of SecY in <Escherichia>___ー <coli>___ー:Evidence for interaction between two components of the secretory machinery." FEBS Letters. 269. 96-100 (1990)
• [文献書誌] Shiozuka,K.,Tani,K.,Mizushima,S.and Tokuda,H.: "The proton motive force lowers the level of ATP required for the <in>___ー <vitro>___ー translocation of a secretory protein in <Escherichia>___ー <coli>___ー." J.Biol.Chem.265. 18843-18847 (1990)
• [文献書誌] Tani,K.,Tokuda,H.and Mizushima,S.: "Translocation of proOmpA possessing an intramolecular disulfide bridge into membrane vesicles of <Escherichia>___ー <coli>___ー:Effect of membrane energization." J.Biol.Chem.265. 17341-17347 (1990)
• [文献書誌] Tokuda,H.,Shiozuka,K.and Mizushima S.: "Reconstitution of translocation activity for secretory proteins from solubilized components of <Escherichia>___ー <coli>___ー." Eur.J.Biochem.192. 583-589 (1990)
• [文献書誌] Shinkai,A.,Akita,M.,Matsuyama,S.and Mizushima,S.: "Quantitative renaturation from a guanidineーdenatured state of the SecA dimer,a 200 kDa protein involved in protein secretion in <Escherichia>___ー <coli>___ー." Biochem.Biophys.Res.Commun.172. 1217-1223 (1990)
• [文献書誌] Yamane,K.,Akiyama,Y.,Ito,K.and Mizushima,S.: "A positively charged region is a determinant of the orientation of cytoplasmic membrane proteins in <Escherichia>___ー <coli>___ー." J.Biol.Chem.265. 21166-21171 (1990)