顕微分光法と酵素免疫組織染色法との共用による高感度・高選択性分析法の開発

• 研究課題/領域番号: 02650535
• 研究種目: 一般研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 工業分析化学
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 大久保 明 (1991) 東京大学, 農学部, 助教授 (20111479); 戸田 昭三 (1990) 東京大学, 農学部, 教授 (40011845)
• 研究分担者: 吉村 悦郎 東京大学, 農学部, 助手 (10130303) ; 山崎 素直 東京大学, 農学部, 教授 (00011982) ; 戸田 昭三 東京大学, 農学部, 名誉教授 (40011845) ; 大久保 明 東京大学, 農学部, 助手 (20111479)
• 研究期間 (年度): 1990 – 1991
• 研究課題ステータス: 完了 (1991年度)
• 配分額: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円); 1991年度: 600千円 (直接経費: 600千円); 1990年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
• キーワード: 顕微分光法 / 免疫組織染色法 / FITC / 酵素免疫組織染色法 / Background fluorescence

研究概要

1.植物細胞質酵素ウレア-ゼの抗体作製
新鮮大豆種子より各種クロマトグラフィ-によりウレア-ゼを精製し電気泳動的に単一な精製酵素を得た。これをBALB/Cマウスに2週間毎に3回免疫し,常法によりミエロ-マ融合細胞を作製,ELISAにより抗体価を検定しながら高抗体価株を選択し,精製抗体を得た。2種のモノクロ-ナル抗体はともにサブクラスがIgG2aであった。大豆以外にナタマメ,バクテリアのウレア-ゼとの交又性があることが判明した。
2.抗原の固定法の検討
ウレア-ゼは細胞質に可溶化しており,これを抗原性を失わずに固定する方法が確立していない。今回PFA法,PLP法について検討を加え,一応固定できることを確認した。
3.組織染色
大豆種子切片に,1.で得られた抗体を結合させ,これに2次抗体を結合させた。2次抗体には抗マウスIgGーFITC蛍光標識,または抗マウスIgGービオチンにアルカリホスファタ-ゼ標識ストレプメアビジン結合の酵素標識法による発色法を行った。FITC標識試料は蛍光顕微鏡写真で組織に蛍光が導入されたことを確認したが,バックグラウンドの自然蛍光との識別が必ずしも明瞭ではなかった。
4.顕微分光測定
FITC標識試料について顕微分光測定を行った。フ-リエ変換顕微鏡に高圧Hgランプで光源強度を上げ,イメ-ジインテンシファイア付きフォトダイオ-ドアレイ検出器により高感度測定を行った。励起光はフィルタ-カットしバックグラウンドの蛍光による妨害の除去を試みたが,植物体中ではリボフラビン等の自然蛍光体が多く,完全な消去は不可能であった。励起光の異なる蛍光標識化合物の開発が待たれる。