| 研究概要 |
1.細胞膜Ca^<2+>ーpumping ATPase活性の特異的測定が可能であり、Gーkinaseによる活性化がみられる、ブタ大動脈の細胞膜分画に、adenosineによる抑制に高感受性(IC_<20>=106μM)のtype2PI kinase活性が見出された。
2.cGMPと精製Gーkinaseは、PI kinaseを活性化したが、adenosineはGーkinaseによる細胞膜Ca^<2+>ーpumping ATPaseの活性化を抑制しなかった。
3.KoskーKosickaらの方法(J.Biol.Chem.,261,3333ー3338,1986)に基づき、calmodulin affinity chromatographyで部分精製した細胞膜CA^<2+>ーpumping ATPaseが、Gーkinaseにより濃度依存的な強い活性化を受けることが見出された。しかし、この活性化は、adenosineでは抑制されず、またphosphatidylinositol phospholipids(PI,PIP,PIP_2)の存在を必要としなかった。さらに、この細胞膜Ca^<2+>ーpumping ATPase部分精製標品には、PI kinase活性を検出できなかった。
4.細胞膜Ca^<2+>ーpumping ATPaseの部分精製標品における、GーkinaseによるCa^<2+>ーpumping ATPaseの活性化に伴い、還元条件下でのSDSーPAGEで分子量240kと138kを示す2つの蛋白質がリン酸化されることが見出された。このうち240k蛋白質のリン酸化のみがGーkinaseによる用量依存的なCa^<2+>ーpumping ATPaseの活性化と高い相関を持つ変化を示し、138k蛋白質のリン酸化量は変化しなかった。
5.通常のcalmodulin affinity chromatographyで精製した細胞膜Ca^<2+>ーpumping ATPaseでは240k、138kのGーkinase基質蛋白質は検出されず、またGーkinaseは活性化作用を示さなかった。
6.Gーkinaseによる活性化がおこる細胞膜Ca^<2+>ーpumping ATPseの部分精製標品を、Gーkinase処理後、新たに開発したcalmodulin affinity chromatographyで再分離したところ、240kと138kのGーkinse基質蛋白質は、この標本に含まれる細胞膜Ca^<2+>ーpumpingの二つのisoform(分子量135kと145k)とは完全に分離した。
7.以上の結果より、Gーkinaseによる細胞膜Ca^<2+>ーpumping ATPaseの活性化には、PI kinaseは関与せず、分子量240kの蛋白質のリン酸化を介して、同酵素を活性化するものと考えられた。また、この活性化にはCa^<2+>ーpumping ATPase自身のリン酸化は起っていないことが示された。
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