| 研究課題/領域番号 |
02670108
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
医化学一般
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
三浦 直行 大阪大学, 細胞工学センター, 助手 (40165965)
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| 研究期間 (年度) |
1990 – 1991
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| 研究課題ステータス |
完了 (1991年度)
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| 配分額 *注記 |
2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
1991年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
1990年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
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| キーワード | 肝細胞 / 転写(制御)因子 / シスエレメント / トランス因子 / HNF1 / HNF4 / 組織特異性 / 転写制御因子 / ホメオドメイン蛋白 / プロモ-タ- |
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| 研究概要 |
ラット肝細胞転写制御因子HNF1の染色体遺伝子のクロ-ニングに成功し、そのプロモ-タ-領域について詳しく解析を行った。主な転写開始点は一箇所で、翻訳開始点より約220塩基上流であった。次に、肝特異的な遺伝子発現に関与する調節領域の解析のため、5^1上流より種々の欠失変異体を作製し、レポ-タ-遺伝子に連結し、肝由来のHepG2細胞に遺伝子導入を行い、各コンストラクトの転写活性を測定した。その結果、ー118まで欠失させても転写活性はほとんど減少せず、ー36まで欠失させると活性はほとんど消失した。このことから、ー118からー36までのDNA断片がHNF1遺伝子の転写に最も重要な調節領域であることが明らかになった。そこで、肝核抽出液を用いて、ー118からー36までのDNA断片をDNaseIフットプリント法で更に詳しく解析したところ、ー60からー40の部位が防護された。ー61からー36までの配列をもつオリゴヌクレオチドを合成し、別の最小プロモ-タ-であるTKーCATに連結し、HepG2細胞に遺伝子導入したところ、このオリゴヌクレオチドの挿入により約3倍の転写活性の上昇が認められた。又、このオリゴヌクレオチドを標識して、肝核抽出液とのゲルシフトアッセイを行うと、複合体を形成し、ー601ー40のシスエレメントに結合するトランス因子が肝核抽出液に存在することを直接証明した。ー60からー40の塩基配列をよく検討してみると、すでに同定されている転写因子HNF4の結合コンセンサス配列に似ていることに気づいた。ApoCIII遺伝子上のHNF4結合部位のオリゴヌクレオチドとの競合実験の結果、ー60からー40のシスエレメントに結合するトランス因子は転写因子HNF4であることが判明した。つまり、転写因子HNF1遺伝子は転写因子HNF4遺伝子の支配下にあるとの結論を得た。
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