| 研究課題/領域番号 |
02670984
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
物理系薬学
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
黒野 幸久 名古屋市立大学, 薬学部, 講師 (50080205)
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| 研究分担者 |
池田 憲 名古屋市立大学, 名誉教授 (50080164)
太田 直子 名古屋市立大学, 薬学部, 助手 (50117818)
四柳 智久 名古屋市立大学, 薬学部, 教授 (40080189)
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| 研究期間 (年度) |
1990 – 1992
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| 研究課題ステータス |
完了 (1992年度)
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| 配分額 *注記 |
2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
1992年度: 400千円 (直接経費: 400千円)
1991年度: 500千円 (直接経費: 500千円)
1990年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
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| キーワード | ヒト血清アルブミン / 薬物結合 / X線結晶講造解析 / 結晶化 / 酵素的活性 / 酵素反応速度論 / キャラクタリゼーション / アシル化ヒト血清アルブミン / X線結晶構造解析 / X線構造解析 / エステラ-ゼ様活性 / キャラクタリゼ-ション |
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| 研究概要 |
1.ヒト血清アルブミン(HSA)の結晶化:HSAの結晶化には蒸気拡散法が最適と考え、脱脂精製したHSA(Fraction V)の結晶化を試みた。板状や針状結晶が再現性よく観察された。しかし0.1-0.2mmの大きさまでしか成長しなかった。X線解析を行うには、0.5-2.0mm程度の結晶が必要である。HSAの純度をSDS-PAGEにより調べたところ、単量体以外のものが数%含まれていた。そこでゲル濾過法により単量体のみを分取し、結晶の成長をはかった。その結果0.4-0.5mmのものが得られた。
2.Acyl-HSAの結晶化:p-Nitrophenyl acetate及びcinnamoylimidazoleとHSAを反応させR-siteをアシル化した。副生成物を透析で除去し、acyl-HSA溶液を凍結乾燥した。このacyl-HSAについて結晶化を試みた。0.2-0.3mmの小さい結晶が得られた。
3.HSAの薬物結合部位のキャラクタリゼーション:HSAの酵素的活性を利用して薬物結合部位のキャラクタリゼーションを行うという、我々が従来開発した方法で詳細な検討を行い、X線構造解析の結果と対比させる。基質としてp-nitrophenyl4-guanidinobenzoate(NPGB)を用いた。HSAはNPGBに対して複数の活性部位を持っており、pkaが約6と10の触媒活性基が関与していることが分かった。次ぎに基質としてamino acid p-nitrophenyl esters(ANPE)を用いた。ANPEの中では、N-CBZ-alanine p-nitrophenyl esterに対する活性が最も強く、活性部位は一箇所(R-site,Tyr-411の近傍)であった。さらに基質(S)としてnitrophenyl phosphinate類を用い、HSAとの反応性の解明及び反応活性部位の探索を行った。
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