| 研究課題/領域番号 |
02671094
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
内分泌・代謝学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
滋野 長平 京都大学, 医学部, 助手 (30170864)
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| 研究分担者 |
開 祐司 大阪大学, 歯学部, 助手 (40144498)
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| 研究期間 (年度) |
1991
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| 研究課題ステータス |
完了 (1991年度)
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| 配分額 *注記 |
2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
1991年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
1990年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
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| キーワード | 副甲状腺ホルモン / 受容体 / 発現クロ-ニング / ^<111>In |
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| 研究概要 |
平成二年度に於て、我々は[dCys^<35>]ラットPTHー(1ー35)NH_2(CysPTH)を合成した。次にDTPAmoietyをスペ-サ-を介して共有結合的にCysPTHに導入した(DPTH)。DPTHのligand probeとしてのeligibilityを検討し、これを ^<111>Inにより標識し、 ^<111>InーDPTHがPTHRをコ-ドするcDNAの発現クロ-ニングにおけるligand probeとして相応しい諸性質をもつことを明らかにした。
平成3年度において、PTHRをコ-ドするcDNAの発現クロ-ニングを試みた。PTHRを多量に発現しているマウス由来ATDC細胞およびウサギ静止軟骨初代培養細胞よりcDNA libraryを作成し、それぞれ、pCDNA1を発現ベクタ-として組み込み、DEAEーdextran法によりCOSー1細胞に導入した。PTHRを発現する細胞は、 ^<111>InーDPTHの結合能を指標として以下のごとく検出を試みた。プラスティクプレ-ト上でCOSー1細胞を ^<111>InーDPTHと結合させたのちautoradiographyを行ない、PTHRを発現している細胞をスクリ-ニングした。positive signalを有するCOS細胞よりplasmid DNAを回収し、electroporationによりE.coliに導入してplasmid DNAを調製した。この方法を繰り返すことにより、PTHRをencodeするcDNA clone poolのenrichmentを試みた。本法を種々のパラメ-タを変更しながら25回試みたが、非特異的信号を除外するに到らず、単一なクロ-ンを得ることはできなかった。平成3年8月、米国ハ-バ-ド大学のSegreらのグル-プが、我々とほぼ同一の方法によるPTHRのクロ-ニングに成功した。
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