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アスパラギン酸アミノトランスフェラ-ゼの反応機構

研究課題

研究課題/領域番号 02680138
研究種目

一般研究(C)

配分区分補助金
研究分野 物質生物化学
研究機関大阪市立大学

研究代表者

広津 建  大阪市立大学, 理学部, 助教授 (10047269)

研究分担者 倉光 成紀  大阪大学, 理学部, 教授 (60153368)
研究期間 (年度) 1990 – 1991
研究課題ステータス 完了 (1991年度)
配分額 *注記
1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
1991年度: 500千円 (直接経費: 500千円)
1990年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
キーワードアミノ基転移酵素 / 反応機構 / X線結晶解析 / 変異型酵素 / 人工変異体 / アミノ基転位酵素 / 高次構造
研究概要

大腸菌アスパラギン酸アミノ基転移酵素(AspAT)はその活性部位に補酵素ピリドキサ-ルリン酸(PLP)を持ち,アスパラギン酸のアミノ基をPLPに渡しピリドキサミンリン酸とオキザロ酢酸を生成する反応を触媒する。AspATおよびその変異型酵素のX線結晶解析を行ない,酵素化学的,遺伝子操作法による研究を参考にして,この酵素の反応機構を解析した。AspATおよび基質アナログとの複合体の結晶を作り,放射光を用いて回析デ-タを収集した。その結果この2つの構造を1.8A^^°の高分解能で決定できた。AspATは基質取り込みに際し,分子全体が大きなコンホメ-ション変化を起こしていた。活性部位の構造の詳細な解析の結果,基質特異性および反応の立体特異性がどのようにして達成されているかを明らかにした。基質取り込み時のコンホメ-ション変化は,基質結合時の数多くの水分子の放出によるエントロピ-の増加が駆動力になって起こると考えられる。触媒反応で重要な役割をする活性部位のアミノ酸残基は,他のアミノ酸で置換すると活性が著しく低下する。この重要な残基の役割を明らかにするために,他のアミノ酸で置換した変異型酵素のX線結晶解析を行なった。Y70Fの全体構造は野生型と同じであり,F70のベンゼン環の位置はY70と同じ位置にあった。活性部位にC_5基質をモデルフィッテイングすることにより,ベンゼン環はC_5基質の認識に関与している可能性が示された。Y70Wでは活性部位の基質アナログが結合していたがPLPとシッフ塩基を作っていなかった。これはミハエリス錯体が補捉できたことを意味する。R292Vの全体構造は野生型と同じである。驚くべきことに292番の電荷の消失にもかかわらず,V292の側鎖はR292のと同じ位置にあった。Y225Fの構造解析から,Y225の水酸基のPLPとの水素結合が反応に重要であることがわかった。

報告書

(3件)
  • 1991 実績報告書   研究成果報告書概要
  • 1990 実績報告書
  • 研究成果

    (15件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (15件)

  • [文献書誌] K.Inoue,S.Kuramitsu,A.Okamoto,K.Hirotsu,T.Higuchi,Y.Morino,H.Kagamiyama: "Tyr 225 in Aspartate Aminotransferase: Contribution of the Hydrogen Bond between Tyr 225 and Coenzyme to the Cafalytic Reaction" J.Biochemistry. 109. 570-576 (1991)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] K.Inoue,S.Kuramitsu A.Okamoto,K.Hirotsu T.Higuchi,H.Kagamiyama: "Site-Directed Mutagenesis of Escherichia cali Asparfate.Aminotransferase: Role of Tyr70 in the catalytic Processes" Biochemistry. 30. 7796-7801 (1991)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] A.Okamoto,K.Hirotsce T.Higuchi,S.Kuramitsu H.Kagamiyama: "Three-dimensional Structure of Asparfate Aminotransferase form Escherichia coli." Imternational Union of Biochemistry Symposium 199 Edited by T.Fukui,H.Kagamiyam,K.Soda,& H.Wada Pergamon Press.107-109 (1991)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] A.Okamoto,K.Hirotsu T.Higuchi,S.Kamitori: "X-rqy Crystallographic Study of Escheriehia coli Aspartale Amino transferase in open and closed forms at 1.8 Å Resolution"

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] K. Inoue, S. Kuramitsu, A. Okamoto, K. Hirotsu, T. Higuchi, Y. Morino and H. Kagamiyama: "Tyr225 in Aspartate Aminotransferase : Contribution of the Hydrogen Bond between Tyr225 and Coenzyme to the Catalytic Reaction." J. Biochemistry. 109. 570-576 (1991)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] K. Inoue, S. Kuramitsu, A. Okamoto, K. Hirotsu, T. Higuchi and H. Kagamiyama: "Site-Directed Mutagenesis of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase : Role of Tyr70 in the Catalytic Processes." Biochemistry. 30. 7796-7801 (1991)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] A. Okamoto, K. Hirotsu, T. Higuchi, S. Kuramitsu and H. Kagamiyama: "Three-dimensional Structure of Aspartate Aminotransferase from Escherichia coli." International Union of Biochemistry Symposium 199. Pergamon press. 107-109 (1991)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] A. Okamoto, K. Hirotsu, T. Higuchi and S. Kuramitsu: "X-Ray Crystallographic Study of Escerichia coli Aspartate Aminotransferase in Open and Closed forms at 1.8A Resolution"

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] K.Inoue,S.Kuramitsu,A.Okamoto,K.Hirotsu,T.Higuchi,Y.Morino,H.Kagamiyama: "Tyr225 in Aspartate Aminotransferase:Contribution of the Hydrogen Bomd between Tyr225 and Coeugyme to the Catalytic Reaction." J.Biochemistry. 109. 570-576 (1991)

    • 関連する報告書
      1991 実績報告書
  • [文献書誌] K.Inoue,S.Kuramitsu,A.Okamoto,K.Hirotsu,T.Higuchi,H.Kagamiyama: "SiteーDirected Mutagenesis of Escherichia coli Aspartate Aminotrans ferase:Role of Tyr70 in the catalytic Processes" Biochemistry. 30. 7796-7801 (1991)

    • 関連する報告書
      1991 実績報告書
  • [文献書誌] A.Okamoto,K.Hirotsu,T.Higuchi,S.Kuramitsu,H.Kagamiyama: "Threeーdimensional Structure of Aspartate Aminotransferase from Escherichia coli." International Union of Biochemistry Symposium 199 Edited by T.Fukui,H.Kagamiyama,K.Soda,& H.Wada Pergamon Press.107-109 (1991)

    • 関連する報告書
      1991 実績報告書
  • [文献書誌] A.Okamoto,K.Hirotsu,T.Higuchi,S.Kuramitsu: "Xーray Crystallographic Study of Escherichia coli Aspartiate Aminotransferase in open and closed forms at 1.8^^° Resolution"

    • 関連する報告書
      1991 実績報告書
  • [文献書誌] Katsura Inoue: "Tyr225 in Aspartate Aminotransferase:Contribution of the Hydrogen Bond between Tyr225 and Coenzyme to the Catalytic Reaction" J.Biochemistry. (1991)

    • 関連する報告書
      1990 実績報告書
  • [文献書誌] Katsura Inoue: "SiteーDirected Mutagenesis of Esherichia Coli Aspartate Aminotransferase:Role of Tyr70 in the Catalytic Process" Biochemistry,.

    • 関連する報告書
      1990 実績報告書
  • [文献書誌] Akihiro Okamoto: "ThreeーDimensional Structures of Escherichia Coli Aspartate Amino travsferase in Open and Closed forms at 1.8 A^^゚ Resolution"

    • 関連する報告書
      1990 実績報告書

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公開日: 1990-04-01   更新日: 2016-04-21  

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