| 研究概要 |
われわれの開発した口腔扁平上皮癌細胞の無蛋白培養系を用いて、ヒト歯肉癌由来無蛋白培養細胞株Ca9ー22PFが何らかのサイトカインを産生しているか否かをBALB3T3細胞のDNA合成促進活性を指標に検討した。その結果Ca9ー22PF培養上清中には静止期のBALB3T3のDNAを促進することのできる活性が少なくとも2種類存在することが明らかとなった。1つは、ゲルクロマトにて分子量約20kから15k付近に溶出され熱に対して不安定な画分であり、ラジオイムノアッセイによりILー1αであることが明らかとなった。他の1つは、35k付近に溶出され熱に対しても抵抗性を示した。この画分は、抗体による中和試験によりPDGFーAAであることが明らかとなった。口腔癌細胞がPDGFーAAを産出していることを蛋白レベルで証明したのは、われわれが初めてであると思われる。
また、既知のサイトカイン産生の可能性をスクリ-ニングする目的にて、サイトカイン遺伝子の発現をPCR法にて検討した。口蓋部扁平上皮癌の頚部転移巣由来の無蛋白培養株ZAPFよりmRNAを分離し、このmRNAをテンプレ-トとしてMoーMLV Reverse Transcriptaseにより一本鎖cDNAを合成した。これを検体としてPCR法により目的の遺伝子の増幅を行い、アガロ-スゲル電気泳動(AGE)により目的の大きさのバンドが認められるか否か検討した。今回目的としたサイトカイン遺伝子として、GーCSF,MーCSF,GMーCSF,ILー3及びILー6の5種類を選んだ。
PCR反応後の各サンプルをAGEにて分析したところ、GーCSF,ILー3,ILー6を目的とした場合には、予想されるバンドを検出することはできなかった。しかし、GMーCSFを目的とした実験では、遺伝子配列から予想される630base pairs(bp)のバンドが検出された。また、MーCSFを目的の遺伝子とした実験では、予想される450bpのバンドが検出された。さらに、このDNAサンプルをMung Bean Nucleaseにより消化し、制限酵素Stu Iによる切断を行いAGEにて解析したところ、遺伝子の制限酵素切断地図より予測される150bp及び300bpのバンドが検出された。これらの結果は、ZAPF細胞が少なくともmRNAレベルではGMーCSF及びMーCSFの遺伝子を発現していることを示している。今後さらに、GMーCSF及びMーCSFが蛋白レベルにおいても構成的に産生されているのかをわれわれの開発した無蛋白培養系を用いて検索する必要があるものと思われる。
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