| 研究課題/領域番号 |
02808029
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
物質生物化学
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| 研究機関 | 宮崎医科大学 |
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研究代表者 |
橋田 誠一 宮崎医科大学, 医学部, 助教授 (10156268)
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| 研究期間 (年度) |
1990 – 1991
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| 研究課題ステータス |
完了 (1991年度)
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| 配分額 *注記 |
1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
1991年度: 100千円 (直接経費: 100千円)
1990年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
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| キーワード | ペプチド / ハプテン / 酵素免疫測定法 / エンザイムイムノアッセイ / ビオチン / ペルオキシダ-ゼ / βーDーガラクトシダ-ゼ / ストレプトアビシン / エンザイムノムノアッセイ / ストレプトアビジン |
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| 研究概要 |
近年、新しいペプチドが次々と発見されてきたが、これらの生体内濃度は低く、高感度な測定が求められている。従来から、ペプチドなどのhaptenは主として競合ラジオイムノアッセイにより測定され、感度はfemtomoleレベルであった。そこで、ペプチドなどのhaptenをattomoleレベルで測定する新しい非競合イムノアッセイ(2点結合免疫測定法)の開発を試みた。〈方法〉2種類の非競合エンザイムノアッセイについて検討した。(1)ペプチドをビオチン化し、ビオチン化ペプチドを抗ペプチドIgG不溶化固相上にトラップする。固相を洗浄し、他のビオチン化物質を除いた後、ビオチン化ペプチドを固相より酸性条件下で溶出する。溶出したビオチン化ペプチドを西洋ワサビ・ペルオキシダ-ゼ標識抗ペプチドFab'とストレプトアビジン不溶化固相を用いて測定する。(2)(1)と同様に抗ペプチドIgG不溶化固相から溶出したビオチン化ペプチドとDNP標識フルオレセインジスルフィド結合ウシ血清アルブミン抗ペプチド抗体を反応させ、生成した複合体を抗DNP抗体不溶化固相上にトラップして、固相を清浄する。固相上のビオチン化ペプチドとβーDーガラクトシダ-ゼ標識アビジンを反応させた後、固相を清浄する。DNPーリジンにより、複合体を固相から溶出して抗フルオレセイン抗体不溶化相上に転移させ、固相を洗浄する。最後にメルカプトエチルアミンにより複合体を固相から溶出して抗IgG抗体不溶化固相に転移させ、固相に結合したβーDーガラクトシダ-ゼ活性を測定する。〈結果〉(1)の方法により10amol、(2)の方法によりlamolのアルギニン・パゾプレッシン、αー心房性ナトリウム利尿ホルモン、アンギオテンシンIなどが測定できるようになった。また、これらの方法で障害となる試料中のたんぱく質は分子篩により除去し、血漿などに含まれる低濃度のペプチドを濃縮することなく測定できるようにした。
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