| 研究課題/領域番号 |
02F00661
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| 研究種目 |
特別研究員奨励費
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 外国 |
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| 研究分野 |
病態医化学
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
村松 喬 名古屋大学, 大学院・医学系研究科, 教授
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| 研究分担者 |
CHEN Guo Yun 名古屋大学, 大学院・医学系研究科, 外国人特別研究員
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| 研究期間 (年度) |
2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
2002年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
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| キーワード | センス / アンチセンス / ポリーN-アセチルラクトサミン / ES細胞 / ノックアウトマウス / 繊維芽細胞 / β1-6アセチルグルコサミンニルトランスフェラーゼ |
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| 研究概要 |
ポリーN-アセチルラクトサミン合成にかかわる酵素β1-6アセチルグルコサミンニルトランスフェラーゼ(IGnT A及びIGnT B)の発現を抑えるのために、IGnT遺伝子の翻訳開始部位をターゲットとするセンス及びアンチセンス(IGnT A : GACCCTTGAGCATGCCTCCGT ; IGnT B : TGCTTTGGGAAGATGGGCTCTTGG)配列をもったモルフォリノ誘導体を作成した。そして、Es細胞、EC細胞(F9及びP19)にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を用いて、酵素活性測定、RT-PCR法による遺伝子の発現解析及び^3H-フコースでメタボリックラベルした後、糖鎖の解析を行った。いずれの場合もセンス、アンチセンスで大きな変化は確認できなかった。
そこでIGnT遺伝子ノックアウトマウスを作成するためにIGnT A、IGnT B共通のエクソン(エクソンIII)を欠失したコンスラクトを作成した。このコンスクラクトをES細胞にエレクトポーレイションでトランスフェクトし、G418で選択した。生き残ったES細胞156個をサザンブロット法で解析した結果、内在性IGnT遺伝子と相同組換えを起したES細胞は1個のみであった。この細胞を用いて、キメラマウスを作成した。IGnTノックアウトマウスを作成するために、キメラマウスを野生型C57BL/6Jと交配して、F1ヘテロマウスを得ることができた。F1のヘテロ同士を交配して、IGnT遺伝子ノックアウトマウス得ることができた。このマウスについてノーザンブロット及びサザンブロットで遣伝子のノックアウトを確認することできた.肝臓、腎臓、小腸、胃の組織抽出物を用いて、IGnTの活性を調べたところ、いずれも活性が野生型に比べて消失していた。現在ノックアウトマウス由来の繊維芽細胞の癌化細胞、さらに、ノックアウトマウス由来のES細胞を樹立し、これらの造腫瘍能をこれらにIGnTをトランスフェクトしたものと比較しょうと研究を続けている。
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