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当研究室では、大腸菌染色体の複製開始蛋白質DnaAに結合したATPの水解により、DnaAの不活化を導く機構、RIDA(Regulatory Inactivation of DnaA)を見出している。RIDAに8は、DNAポリメラーゼIIIβサブユニットがDNAにロードされ、βクランプを形成することが必要である。よって、複製装置にはフィードバック的に、複製開始を抑制するという概念が提唱される。最近、RIDAに必須な新奇蛋白質Hdaが同定され、RIDA構成因子が出揃った。そこで本研究では、Hisタグ融合型としてHdaを精製し、RIDA反応を生化学的に解析した。
まず、RIDA再構成系(DNAにロードされたβクランプをゲル濾過により単離し、これを用いてHdaに依存したDnaA結合性ATPの加水分解を行う)を構築し解析した結果、HdaはADP結合により活性型となることが示唆された。実際、フィルターバインディング法により、HdaはADPに高い特異性を持って結合することがわかった(Kd値、約2μM)。
次に、βクランプ・Hda・DnaAの3者の相互作用について検討した。まず、プルダウン法により、βサブユニットはHdaと直接結合することがわかった。さらに、ゲル濾過による解析から、DNAにロードさせたβサブユニット(βクランプ)はHdaおよびATP結合型DnaAにそれぞれ単独で結合することが見出された。よって、βクランプを足場にしてHdaとATP-DnaAが相互作用する可能性が示唆される。このときHdaがDnaA結合性ATPに作用し、その加水分解を促しているのかもしれない。DnaAおよびHdaはともにAAA+型ATPase蛋白質であるが、一部のAAA+蛋白質については、複合体を形成し、分子間の境界でATP加水分解を行うことが提唱されている。RIDAの分子機構もこれと矛盾しないと思われる。
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