X線吸収スペクトルの時間分解測定による錯体,金属タンパク質の反応過程の解析

• 研究課題/領域番号: 03231218
• 研究種目: 重点領域研究
• 配分区分: 補助金
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 西郷 敏 自治医科大学, 医学部, 助教授 (70049071)
• 研究分担者: 松下 正 高エネルギー物理学研究所, 放射光, 教授 (40092332) ; 柴山 修哉 自治医科大学, 医学部, 助手 (20196439)
• 研究期間 (年度): 1991
• 研究課題ステータス: 完了 (1991年度)
• 配分額: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円); 1991年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
• キーワード: 金属タンパク質 / 反応中間体 / 急速凍結法 / X線吸収スペクトル / EXAFS

研究概要

高速反応に伴うX線吸収スペクトルの変化を測定するためには、特別の工夫が必要である。一つの方法は、急速凍結により、反応を停止させ、その後に時間をかけてスペクトルを測定することである。本研究は、従来の経験を基礎に、このような目的のための実用的な装置を開発し、いくつかの測定を行った。
西洋わさびペルオキシダ-ゼは、反応の過程でいくつかの中間体が出現する。このうち複合体IIのヘム鉄近傍の講造について、X線吸収スペクトル法による二つの異なる結果が報告されている。急速凍結法により複合体IIを調製し、そのX線吸収スペクトルを測定した。その結果、X線の照射により鉄吸収端の位置が低エネルギ-側に移動し、ヘム鉄が還元を受けることが明らかになった。信頼のおけるデ-タを得るためには、このような還元を抑えなければならない。ラジカルと反応性の高いいくつかの物質について調べたところ、ジメチルスルホキシドがX線による還元を大幅に抑えることが分かった。この物質の共存下で複合体IIの測定を行う予定である。
ジペプチドやそのアナロダはインヒビタ-としてサ-モライシンに結合するが、分解されない。さまざまなインヒビタ-と酵素の複合体のX線結晶解析がなされ、相互作用の様子が明らかにされている。結晶講造解析のなされている5種類のインヒビタ-とサ-モライシンの複合体の亜鉛吸収端近傍のX線吸収スペクトルを測定した。インヒビタ-のカルボキシル基のO_<ε1>,カルボニル基のO、ホスホリル基のOが水分子のOに代わって配位する場合には、スペクトルの主ピ-クの低エネルギ-側の肩が単独の酵素に比べて顕著に現れた。今後、これらの知見をもとにして、酵素と基質が反応するときに生ずる中間体のスペクトルを測定、解析する予定である。