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タンパク質の膜透過に伴う高次構造の制御に関する研究

研究課題

研究課題/領域番号 03264209
研究種目

重点領域研究

配分区分補助金
研究機関名古屋大学

研究代表者

遠藤 斗志也  名古屋大学, 理学部, 教授 (70152014)

研究分担者 中井 正人  名古屋大学, 理学部, 助手 (90222158)
研究期間 (年度) 1991
研究課題ステータス 完了 (1991年度)
配分額 *注記
2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
1991年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
キーワード膜透過 / 高次構造変化 / ミトコンドリア / 熱ショックタンパク質
研究概要

膜透過に伴う前駆体タンパク質の高次構造変化を解析するために、ミトコンドリアタンパク質前駆体pCOX IVーDHFRにin vitroでケイ光プロ-ブを導入することを試みた。pCOX IVーDHFRには、延長ペプチド部分と成熟体部分に一つずつシステイン残基があるので、延長ペプチド部分のシステイン残基をセリン残基に置換した変異体を作り、これを大腸菌に大量発現させて精製した。次にタンパク質を尿素で変性させ、内部より露出した製熟体部分の唯一のシステスイン残基をケイ光性のMIANSで架橋反応によりラベルした。続いて透析により、ラベル化試薬と尿素を取り除き、架橋反応を停止させると共に、タンパク質を巻き戻らせた。しかしこのタンパク質濃度では、タンパク質は単量体として巻き戻らずに、凝集して沈殿を形成することがわかったので、沈殿したタンパク質を再び尿素で可溶化した。可溶化した変性タンパク質を緩衝液中に希釈して、濃度の低い状態で巻き戻らせることにより、今度は凝集することなくラベル化前駆体に元の立位構造をとらせることができた。前駆体の内部に導入されたケイ光プロ-ブ(MIANS)は、ミトコンドリア膜透過に伴う立体構造変化を追跡するための良いプロ-ブとなるものと考えられる。
膜透過に伴う前駆体タンパク質の高次構造を制御する因子としての熱ショックタンパク質hsp70の、in vivoでの局在部位(細胞質ゾル、ミトコンドリアなど)特異性を明らかにするために、酵母を用いた分子生物学的実験系を準備した。酵母の細胞質ゾルのhsp70をミトコンドリアのhsp70に置き換えた形質転換体、ミトコンドリアのhsp70を細胞質ゾルのhso70に置き換えた形質転換体などを作製し、置き換わったhsp70が機能を代替できるかどうかを検討した。

報告書

(1件)
  • 1991 実績報告書
  • 研究成果

    (1件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (1件)

  • [文献書誌] Endo,T.: "Coーoperative binding of hsp60 may promote transfer from hsp70 and correct folding of imported proteins in mitochondria" FEBS Letters. 293. 1-3 (1991)

    • 関連する報告書
      1991 実績報告書

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公開日: 1991-04-01   更新日: 2016-04-21  

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