| 研究概要 |
コリシンE3は大腸菌colプラスミドが作る殺菌蛋白質で,C末端のT2Aドメインの持つRNase活性でリボゾームを失活させる。プラスミドはT2Aに対する特異的阻害蛋白質ImmE3を作って致死を免れる。相同性の高いE3とE6はT2A-Imm間の特異性が異なるため,ImmE3はE6を,ImmE6はE3を防ぐことができない。蛋白質間の分子認識をT2A-Immについて遺伝的・構造化学的に解析した。
1.Immに対するコリシンE3,E6の特異性決定部位:T2Aドメインを区切る制限酵素部位を導入し,小領域をE3とE6の間で交換して発現させ,Immとミスマッチであるほど致死性が高いという基準で特異決定領域を限定すると,E3,E6とも481〜499に候補が絞られ,E3ではPro481とLys496が共同してE3特異性を決めていることが分かった。
2.E3の酵素活性中心の特定:E3は配列のみから活性中心を特定できない。他の加水分解酵素の例からGluかAspが一般酸塩基触媒であると想定し,E3とE6で共通なGluとAspのうち電荷を消す変異にもE/D置換にも感受性なGlu517,及び近くのHis513が活性中心であると推定した。これらの変異体は蛋白質は安定に合成されるが,in vitroのリボソーム失活活性も失っていた。
3.NMRによるImm蛋白質の立体構造決定:ImmE3は逆平行4本鎖βシートとループからなり,シートの片面は遺伝的に決定された特異性決定基の側鎖を含んで溶媒に面している。現在E3とE6のT2A及びT2A-Imm複合体の立体構造を決定中である。
4.Chemical Shift Perturbation分析:安定同位体標識と尿素変性/再生手法により,T2A-ImmのT2Aのみ,及びImmのみが標識されたヘミラベル複合体を調製した。これらのHMQCスペクトルを比較して,T2AとImmが変性/再生過程後もネイティブな立体構造を保つことを明らかにし,さらに複合体形成での結合面を明らかにした。特異性決定基はいずれも結合面の周辺部にあった。
|
