| 研究課題/領域番号 |
03454109
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| 研究種目 |
一般研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
基礎獣医学
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| 研究機関 | 国立予防衛生研究所 |
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研究代表者 |
巽 正志 国立予防衛生研究所, 獣医科学部, 主任研究官 (00133629)
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| 研究分担者 |
網 康至 国立予防衛生研究所, 動物管理室, 研究員 (10202699)
森川 茂 国立予防衛生研究所, ウイルスI部, 主任研究官 (00167686)
山田 靖子 国立予防衛生研究所, 動物管理室, 主任研究官 (20158223)
松浦 善治 国立予防衛生研究所, ウイルスII部, 室長 (50157252)
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| 研究期間 (年度) |
1991 – 1992
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| 研究課題ステータス |
完了 (1992年度)
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| 配分額 *注記 |
6,500千円 (直接経費: 6,500千円)
1992年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
1991年度: 4,400千円 (直接経費: 4,400千円)
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| キーワード | カニクイザル / CD4 / CD8 / 遺伝子クローニング / 発現 / キメラCD4 / SIV / HIV / 形質転換細胞 / CD4遺伝子、 / CDRー1領域、 / PCR, / アミノ酸置換 / cDNA / 塩基配列決定 |
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| 研究概要 |
カニクイザル胸腺細胞よりGubler-Hoffmann法にてcDNAを合成しλZAPベクターへ組み込み、サルリンパ球ライブラリを構築した。塩基配列が判明しているヒトCD4およびCD8遺伝子より、コード全領域を含む特定部位を選別し、合成プライマーを作製し、PCR法にて増幅した核酸断片をプロブにしてプラークハイブリダイゼーション法にてサル遺伝子が組み込まれているファージを選択しサルCD4およびCD8遺伝子をクローニングし全塩基配列を決定した。サルCD4遺伝子のコート領域は1377塩基よりなり、ヒトと比較して55塩基のみが異なっており、95%の高い相同性を示した。アミノ酸配列レベルでは、シグナル蛋 白および膜貫通部位ではそれぞれ1アミノ酸の置換があるのみで、細胞内部位は全く相同であった。サルCD4分子もヒトCD4分子と同様、そのcystine殘基の位置は保存され、細胞外溝成成分は4個のドメインから成り、スーパー免疫グローブリン遺伝子ファミリーに属することが示された。アミノ酸配列レベルでのカニクイザルとヒトCD4分子の相違は、免疫グロブリンL鎖可変部位と相同性を有するドメイン1ではCDR1領域内とその近傍に集積していた。これらの領域でのアミノ酸の置換は疎水性分析により、ヒトCD4分子と極性が転換する可能性が示された。サルとヒトCD4細胞外Domainの組み替えキメラCD4遺伝子を作製し、哺乳類細胞発現ベクターに組み込みヒト株化細胞Helaで形質転換組胞を樹立した。この形質転換細胞のHIV-1,HIV-2およびSIVに対する感受性をSyncitium形成とPCR法によるProvirusの検出により検討したところ、HIV-1との結合部位であるヒトCD4Domain1を有するヒトおよびキメラCD4のみならず、サルおよびヒトCD4Domain1を有しないキメラCD4分子を発現した形質転換細胞もHIV-1に感染した。一方サルCD8遺伝子のコード領域は708塩基よりなり、ヒトと比較して35塩基のみが異なっており、95%の高い相同性を示した。アミノ酸配列レベルでは、シグナル蛋白は3,J-LikeDomainは2、膜貫通部位は1、および細胞内部位は2アミノ酸の置換があるのみで高い相同性を示したが、V-likeDomainでは7アミノ酸の置換を認めた。サルCD8分子もヒトCD8分子と同様、そのcystine殘基の位置は保存され、細胞外構成成分は1個のV-likeDomainと1個のJ-likeDomainから成り、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーに属することが示された。in vitro TranslationによりサルCD8遺伝子はそのアミノ酸配列より期待される蛋白が合成された。
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