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脳Cl^-ポンプの精製と活性部位蛋白一次構造の解析

研究課題

研究課題/領域番号 03454148
研究種目

一般研究(B)

配分区分補助金
研究分野 薬理学一般
研究機関関西医科大学

研究代表者

稲垣 千代子  関西医科大学, 医学部, 教授 (60025640)

研究分担者 三上 斗支子 (瓜生 斗支子 / 三上 斗友子 / 瓜生 斗友)  関西医科大学, 医学部, 助手 (40203608)
原 満良  関西医科大学, 医学部, 助手 (50192282)
大谷 ひとみ  関西医科大学, 医学部, 助手 (40140272)
井上 雅史  関西医科大学, 医学部, 講師 (90203257)
大森 京子  関西医科大学, 医学部, 講師 (90152256)
研究期間 (年度) 1991 – 1993
研究課題ステータス 完了 (1993年度)
配分額 *注記
2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
1993年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
1992年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
キーワードクロライドイオンポンプ / 脳 / 蛋白一次構造 / 神経細胞 / Cl^--ATPase / エタクリン酸
研究概要

1.Cl^-ポンプの精製:非イオン性可溶化剤MEGA-10は、ラット脳から調整した細胞膜顆粒のNa^+,K^+-ATPaseをほぼ完全に、またanion-insensitive ATPaseを部分的に失活させたが、Cl^--ATPaseを失活させずに可溶化し、可溶化後のCl^--ATPaseは阻害剤エタクリン酸に対する感受性を保持していた。可溶化したCl^--ATPaseを、CM-SepharoseおよびMonoQ-HPLCにより分画し、活性ピークのポリアクリルアミド電気泳動によりCl^--ATPase活性分布に対応する520kDaおよび580kDaの蛋白を採取した。
2.再構成したCl^-ポンプのCl^-輸送形式:MEGA-10により可溶化したCl^--ATPaseを、レシチン膜顆粒に再構成し、ATP依存性Cl^-輸送活性を検出することに成功した。再構成膜にはレシチンのほかリン脂質としてphosphatidylinositol-4-monophosphateを加えることが、より選択的なCl^--ATPaseの再構成を可能にした。Cl^--ATPase再構成膜におけるATP依存性Cl^-輸送は、エタクリン酸、フロセミドおよびバナジン酸に対して細胞膜顆粒の場合と同様の感受性を示し、さらにK^+イオノフォアと40mM K^+、またはH^+イオノフォア共存により促進されたので、Cl^--ATPaseによる起電的Cl^-輸送であると推定された。520kDa蛋白は細胞膜顆粒に比べ約20倍のCl^-ポンプ活性を示した。
3.Cl^-ポンプのサブユニットと蛋白一次構造:520kDaのSDS-ポリアクリルアミド電気泳動(SDS-PAGE)により、少なくとも4種のサブユニット(110kDa、97kDa、60kDa、47kDa)が認められた。520kDa蛋白を抗原として作製したウサギ抗血清は、60kDaサブユニットに結合し、Cl^--ATPase活性を阻害した。520kDa蛋白のSDS-PAGE展開後のポリペプチドを電気泳動的にニトロセルロース膜に移し、60kDaポリペプチドを気相プロテインシーケンサーにて分析したところ、N末端アミノ酸配列はSPGGGSISIPSGITHと推定された。

報告書

(4件)
  • 1993 実績報告書   研究成果報告書概要
  • 1992 実績報告書
  • 1991 実績報告書
  • 研究成果

    (37件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (37件)

  • [文献書誌] Inoue,M.: "An ATP-driven Cl^- pump regulates Cl^- concentrations in rat hippocampal neurons." Neurosci.Lett.134. 75-78 (1991)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
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      1993 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hara,M.: "Uneven distribution of intracellular Cl^- in rat hippocampal neurons." Neurosci.Lett.143. 135-138 (1992)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
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      1993 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Inoue,M.: "Elhacrynic acid-induced convulsions and brain transm:Hers." Eur.J.Pharmacol.221. 135-137 (1992)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
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      1993 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Inagaki,C.: "Neuronal intracellular chloride ion concentrations and their regulatory mechanisms." Folia pharmacol jopon. 99. 307-315 (1992)

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      1993 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Ohnishi,S.: "Delayed shortening and shrinkage of cochlear outer hair cells" Am.J.Physiol.263. C1088-C1095 (1992)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
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      1993 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Zeng,X-t.: "Electrogenic and phosphatidylinositol-4-phosphate-stimulated Cl^- transport in‥" Brain Research. (印刷中). (1994)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1993 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Inagaki,C.(分担): "Electrogenic Chloride Transporters in Biological Membranes" Springer-Verlag, 500 (1994)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1993 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] 大谷ひとみ 稲垣千代子: "分子循環器学(心筋クロライドチャネル)" 日本臨床, 270 (1993)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1993 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Inoue, M., Hara, M., Zeng, X.-T., Hirose, T., Ohnishi, S., Yasukura, T., Uriu, T., Minato, A.and Inagaki, C.: "An ATP-driven Cl^- pump regulates Cl^- concentrations in rat hippocampal neurons." Neurosci.Lett.134. 75-78 (1991)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1993 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hara, M., Inoue, M., Yasukura, T., Ohnishi, S., Mikami, Y.and Inagaki, C.: "Uneven distribution of intracellular C^- in rat hippocampal neurons." Neurosci.Lett.143. 135-138 (1992)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1993 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Inoue, M., Hirose, T., Yasukura, T.and Inagaki, C.: "Ethacrynic acid-induced convulsions and brain neurotransmitters." Eur.J.Pharmacol.221. 135-137 (1992)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1993 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Inagaki, C., Hara, M.and Inoue, M.: "Neuronal intracellular chloride ionconcentrations and their regulatory mechanisms." Folia pharmacol.japon.99. 307-315 (1992)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1993 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Ohnishi, S., Hara, M., Inoue, M., Yamashita, T., Kumazawa, T., Minato, A.and Inagaki, C.: "Delayd shortening and shrinkage of cochlear outer hair cells." Am.J.Physiol.263. C1088-C1095 (1992)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1993 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Ohnishi, S., Hara, M., Inagaki, C., Yamashita, T.and Kumazawa, T.: "Regulation of Cl^- conductance in delayd shortening and shrinkage of outer hair cells." Acta Otolaryngol.(Stockh). Suppl.500. 42-45 (1993)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
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      1993 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Zeng, X-t., Hara, M.and Inagaki, C.: "Electrogenic and phosphatidylinositol-4-phosphate-stimulated C^- transport by Cl^- pump in the rat brain." Brain Research. (in press). (1994)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1993 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Inagaki, C., Hara, M.and Inoue, M.: Cl^- transporting ATPase in the rat brain.Electrogenic Chloride Transporters in Biological Membranes (Springer-Verlag)(in press), (1994)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1993 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Ohnishi,S: "Regulation of Cl^‐ conductance in delayed shortening and shrinkage of outer hair cells." Acta otolaryngol(Stockh). Suppl500. 42-45 (1993)

    • 関連する報告書
      1993 実績報告書
  • [文献書誌] Zeng,X‐T: "Electrcgenic and phosphatidylinositol‐4‐monophosphate‐stimulated Cl^‐ transport by Cl^‐ pump in the rat brain." Brain Reseorch. (印刷中). (1994)

    • 関連する報告書
      1993 実績報告書
  • [文献書誌] Omori,K.: "A cytosolic peptide potentiates the GTP effect on B‐aorenergic response at adenylak cyclase" American Journal of Physiology. (印刷中). (1994)

    • 関連する報告書
      1993 実績報告書
  • [文献書誌] Hara,M.: "Spatial diversity of chloride transporters in hippocampal" Ann.N.Y.Acad.Sci.707. 421-423 (1993)

    • 関連する報告書
      1993 実績報告書
  • [文献書誌] Inagaki,C.(分担): "Electrogenic chloride Transporters in Biological Membranes" Springer‐Verlag, 500(20) (1994)

    • 関連する報告書
      1993 実績報告書
  • [文献書誌] 大谷ひとみ.稲垣千代子(分担): "分子循環器学(心筋クロライドチャネル)" 日本臨床, 270 (1993)

    • 関連する報告書
      1993 実績報告書
  • [文献書誌] Hara,m.: "Uneven distribution of intracellular Cl^- in rat hippocampal neurons" Neuroscience Letters. 143. 135-138 (1992)

    • 関連する報告書
      1992 実績報告書
  • [文献書誌] Inoue,m.: "Ethacrynic acid-induced convulsions and brain neurotransmitters in mice" European Journal of Pharmacology. 221. 135-137 (1992)

    • 関連する報告書
      1992 実績報告書
  • [文献書誌] Ohnishi,S.: "Delayed shortening and shrinkage of cocklear outer hair cells." American Journal of Physiology. 263. C1088-C1095 (1992)

    • 関連する報告書
      1992 実績報告書
  • [文献書誌] 稲垣 千代子: "(総説)神経細胞内クロライドイオン濃度の制御系とその人工修飾" 日本薬理学雑誌. 99. 307-315 (1992)

    • 関連する報告書
      1992 実績報告書
  • [文献書誌] Hirose,T.: "Enflurane-induced release of an exctatory amino acid,glutamate,from mouse." Anethesiology. 77. 109-113 (1992)

    • 関連する報告書
      1992 実績報告書
  • [文献書誌] Otani,H.: "Different patterns of protein kinase C redistrirution mediated by α_1-adreneecptor" British Journal of Pharmacology. 107. 22-26 (1992)

    • 関連する報告書
      1992 実績報告書
  • [文献書誌] Inagaki,C.(分担): "Eleetrogenic chloride Transporters in Biological Membranes." Springer-Verlag, 20 (1993)

    • 関連する報告書
      1992 実績報告書
  • [文献書誌] 稲垣 千代子(分担): "実験医学:膜電位依存性Cl^-チャネル(イオンチャネルとレセプター)" 羊土社, 6 (1992)

    • 関連する報告書
      1992 実績報告書
  • [文献書誌] M.Inoue et al.: "Ethacrynic acid-induced glutamate release from the mouse brain synaptosomes." Brain Research. 543. 160-162 (1991)

    • 関連する報告書
      1991 実績報告書
  • [文献書誌] T.Uriu et al.: "Two types of clathrine-coated vesicles in the rat brain:Analysis for cellular origin" J.Neurochemistry. 56. 1543-1556 (1991)

    • 関連する報告書
      1991 実績報告書
  • [文献書誌] M.Inoue et al.: "An ATP-driven Cl^- pump regulates Cl^- concentrations in hippocampal neurons." Neurosci.Lett.134. 75-78 (1991)

    • 関連する報告書
      1991 実績報告書
  • [文献書誌] Y.Kunugi et al.: "An ATP-driven Cl^- pump in the rat kidney." Japan.J.Pharmacol.57. 167-174 (1991)

    • 関連する報告書
      1991 実績報告書
  • [文献書誌] S.Ohnishi et al: "Delayed shortening and shrinkage of cochlear outer hair cells." Am.J.Physiol.

    • 関連する報告書
      1991 実績報告書
  • [文献書誌] T.Hirose et al.: "Enflurane-induced relaese of excitatory amino acids from the mouse brain synapto-somes." Anesthesiology.

    • 関連する報告書
      1991 実績報告書
  • [文献書誌] C.Inagaki et al.: "Eletrogenic Chloride Transporters in Biological Membranes." Springer-Verlag, (1992)

    • 関連する報告書
      1991 実績報告書

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公開日: 1992-04-01   更新日: 2016-04-21  

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