| 研究概要 |
ガングリオシドに特徴的に見いだされるNeuAcα2-8NeuAc構造やNeuAcα2-3Gal構造を有する生理活性ガングリオシド(GM3,GD3,GQ1bなど)の合成にかかわるα2-8シアル酸転移酵素およびα2-3シアル酸転移酵素に性状を明らかにする為に以下の研究を遂行した。
[1]シアル酸転移酵素の高感度測定法の開発と応用
糖脂質シアル酸転移酵素の測定法の簡便化および高感度測定系の開発を試みた。蛍光プローブ、ピリジルアミン(PA)を糖脂質のオリゴ糖に導入し、このPA化オリゴ糖が糖脂質シアル酸転移酵素の基質になるか否かを検討した。ラット肝臓ゴルジ装置膜を酵素源とし、PA-ラクトース(Lac-PA)、PA-α2→3シアリルラクトース(Neu-Lac-PA)を基質として用した場合、PA-α2→3シアリルラクトースのみが良好な基質となり、PA-ラクトースへのシアル酸の取り込みは検出出来なかった。Neu-Lac-PA基質に関して、Km,至適pH,金属イオン要求性は糖脂質を基質とした場合と類似していたが活性に及ぼすdetergentの要求性は約1/10程度であった。つぎにGM3合成酵素の蛍光測定のため、糖供与体CMP-NeuAcの蛍光標識体FITC-CMP-NeuAcのラクトシルセラミドへの取り込みを検討した。その結果、良好な酵素基質になることが判った。
[2]シアル酸転移酵素の分子検出のためのアフィニティー標識法の開発
光反応性ラクトシルセラミドジアジリン誘導体の合成とGM3合成酵素への応用を試みた。ウシ脳灰白質膜画分を酵素源としてGM3合成酵素への親和性をラクトシルセラミドとの競合、およびLac部分へのシアル酸の取り込みを指標に検討し、ほぼ同定度の良好な基質になることが判った。合成基質の光分解はすみやかに進行し光反応性の点でもラベル試薬として望ましい性質を示した。アビジン-ビオチン系を検出系に利用できる本化合物は目的GM3合成酵素の分子検索に有用なリガンドと考えられた。
[3]アフリカツメガエル卵母細胞のガングリオシド組成、生合成経路、初期発生における糖脂質分子種変化
アフリカツメガエル卵母細胞のガングリオシド組成、生合成経路、初期発生における糖脂質分子種変化について調べた。その結果(1)主要なガングリオシドの構造をGalNAc-GM1bと決定した。(2)卵母細胞には、アシアロGM1からGM1bを経てGalNAc-GMIbが合成される非常にユニークな合成経路を見いだした。(3)特定のガングリオシド(GM3,GMla,GalNAc-GM1b)が発生に伴って変化することを見いだした。
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