| 研究課題/領域番号 |
03454175
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| 研究種目 |
一般研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
実験病理学
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
守内 哲也 東海大学, 医学部, 助教授 (20174394)
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| 研究分担者 |
谷口 泰史 東海大学, 医学部, 助手 (30207188)
吉村 眞一 東海大学, 医学部, 助手 (30230808)
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| 研究期間 (年度) |
1991 – 1992
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| 研究課題ステータス |
完了 (1992年度)
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| 配分額 *注記 |
6,600千円 (直接経費: 6,600千円)
1992年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
1991年度: 5,300千円 (直接経費: 5,300千円)
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| キーワード | ヒト / 発生 / ホメオボックス / リコンビナント / 抗体 / 免疫組織化学 / ホメオボックス蛋白 / 大腸菌発現ベクタ- / マルト-ス結合蛋白 / 蛋白精製 |
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| 研究概要 |
1.Hox4B cDNA全体の大腸菌における発現
最初の実験では、Hox4B遺伝子cDNAの全体を発現ベクターpIH888プラスミドに挿入した。この組み換えDNAを大腸菌に遺伝子導入した場合、菌は増殖せず、ホメオボックスが大腸菌にとってtoxicと考えられた。
2.ホメオボックスを除いたHox4B蛋白前半部の大腸菌による産生
toxic sequenceと考えられるホメオボックス配列を取り除き、Hox4B遺伝子をホメオボックスを含まない前半部をpIH888プラスミドに組み換え、大腸菌を形質転換させることに成功した(pIH4Bb)。次いで、pIH4BbのHox4B遺伝子の直後に翻訳終止コドンTAGを導入した(pIH4Bb)。発現ベクターとHox4B遺伝子の結合部について塩基配列を決定した結果、Hox4B遺伝子が設計通りにpIH888プラスミドに挿入され、なおかつそのアミノ酸配列を崩さずに融合蛋白が産生されている事が確認された。このpIH48cを大腸菌に遺伝子導入し、増殖させた大腸菌よりペリプラスム蛋白を調整し、SDS-PAGEにて電気泳動して蛋白質を染色したところ、57KDaの濃い一本の融合蛋白のバンドが染色された。
3.抗Hox4B抗体の作成
57KDaの蛋白をプレパラテイブ・ゲル電気泳動で選択的に回収し、家兎に免除して抗体を得て、アフィニティーカラムでさらに精製した。
4.イムノブロット解析
受精後13日のマウス胎仔のホモジネートを用いてイムプロットを行ったところ、64kDaのバンドが一本だけ検出され、この抗体の特異性が確認された。
5.マウス胎仔のパラフィン切片を抗Hox4B抗体で免疫染色したところ、幼若な軟骨細胞、脊髄神経細胞、および副腎髄質が染った。この結果に基づき、現在ヒト副腎および褐色細胞種の免疫染色を行っている。
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