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ミトコンドリア呼吸系の複合体III及び複合体Iの結晶化とX線結晶解析

研究課題

研究課題/領域番号 03454565
研究種目

一般研究(B)

配分区分補助金
研究分野 生体物性学
研究機関姫路工業大学

研究代表者

吉川 信也  姫路工業大学, 理学部, 教授 (40068119)

研究分担者 月原 冨武 (月原 富武)  徳島大学, 工学部, 教授 (00032277)
伊藤 恭子  姫路工業大学, 理学部, 助手 (70206316)
研究期間 (年度) 1990 – 1993
研究課題ステータス 完了 (1993年度)
配分額 *注記
5,300千円 (直接経費: 5,300千円)
1993年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
1992年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
1991年度: 2,700千円 (直接経費: 2,700千円)
キーワードNADH-ユビキノン還元酵素 / ユビキノール・チトクロムC還元酵素 / 膜タンパク質 / 呼吸鎖電子伝達系 / タンパク質結晶化 / 結晶構造解析 / チトクロムbc,複合体 / 複合体I / チトクロムbC_1,複合体
研究概要

複合体IIIの結晶化を目指してまず、精製法を再検討した。チトクロム酸化酵素の経験にもとづいて、界面活性剤による可溶化の後は塩析法によって純化するHatefiやRieskeの方法の改良を試みた。その結果2日で約0.6グラムの精製標品が得られるようになった。さらに最終標品に含まれているコール酸を非イオン性界面活性剤であるドデシルシュークロースに完全に置き換えた。これによって標品の安定性な格段に高まった。Tris-HCl緩衝液中で固形のポリエチレングリコールを沈澱剤として結晶化したところ、単斜晶系の結晶が得られた。これは7.5A分解能のx線回折像を示したが、非常に物理的衝撃に敏感で、かつ双晶になりやすく、x線結晶解析は容易でないことが判明した。そこで、他の結晶系の結晶を求めて、まずこの結晶の結晶化条件に及ぼす要因を検討した。緩衝液をリン酸カリウムに変換すると、分解能6.5Aのx線回折を示す六方晶系の結晶が得られた。この結晶の成長はリン酸濃度に非常に敏感で、50mM付近で2-3mMの濃度の違いで、結晶の質と大きさが大きく影響された。また最適濃度は標品のロットにより10mM程度変化した。この再現性を高めるため、結晶化によって精製した標品を結晶化したところ、正方晶が得られたが、再現性も結晶の完全性も目立って向上しなかった。一方、亜鉛イオン存在下では六方晶の完全性は同様であるが、結晶成長の再現性は著しく向上した。
複合体I(NADH-ユビキノン還元酵素)の結晶化もまず精製法の検討から開始した。Rieskeの方法を改良して、ウシ心筋1.2Kgから約0.9グラムの精製標品が得られるようになった。この標品の組成も酵素活性もロテノン阻害も文献値とよく一致していた。ハンプトン社のクリスタルスクリーンによってこの標品の結晶化条件を探索したところ、スフェルライトではあるがはっきりと複屈折を示す結晶が得られた。

報告書

(4件)
  • 1993 実績報告書   研究成果報告書概要
  • 1992 実績報告書
  • 1991 実績報告書
  • 研究成果

    (11件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (11件)

  • [文献書誌] Yoshikawa,S.: "Strategies for crystallization of membrane protein complexes." J.Cryst.Growth. 122. 298-302 (1992)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1993 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kubota,T.: "Kinetic mechanism of beef heart ubiquinol:cytochrome c oxidoreductase." J.Biochem.111. 91-98 (1992)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1993 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kubota,T.: "Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of bovine heart mitochondrial cytochrome bc_1 complex." J.Mol.Biol.221. 379-382 (1991)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1993 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kawamoto,M.: "New crystal forms and preliminary X-ray diffraction studies of mitochondrial cytochrome bc_1 complex from bovine heart." J.Mol.Biol.(submitted).

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1993 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Yoshikawa, S., Shinzawa-Itoh, K., Ueda, H., Tsukihara, T., Fukumoto, Y., Kubota, T., Kawamoto, M., Fukuyama, K.and Matsubara, H.: "Strategies for crystallization of membrane protein complexes." J.Cryst. Growth. 122. 298-302 (1992)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1993 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kubota, T., Yoshikawa, S.and Matsubara, H.: "Kinetic mechanism of beef heart ubiquinol : cytochrome c oxido-reductase." J.Biochem.111. 91-98 (1992)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1993 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kubota, T., Kawamoto, M., Shinzawa-Itoh, K., Yoshikawa, S., Matsubara, H.: "Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of bovine heart mitochodrial cytochrome bc_1 complex." J.Mol. Biol.221. 379-382 (1991)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1993 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kawamoto, M., Kubota, T., Matsunaga, T., Fukuyama, K., Matsubara, H., Shinzawa-Itoh, K., and Yoshikawa, S.: "New crystal form and preliminary X-ray diffraction studies of mitochondrial cytochrome bc_1 comples from bovine heart." submitted to J.Mol. Biol.

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1993 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] S.Yoshikawa: "Strategies for crystallization of membrane protein complexes." J.Cryst.Growth.122. 298-302 (1992)

    • 関連する報告書
      1992 実績報告書
  • [文献書誌] S.Yoshikawa: "Strategies for crystallization of membrane protein complexes." J.Cryst.Growth.

    • 関連する報告書
      1991 実績報告書
  • [文献書誌] T.Kubota: "Crystallization and preliminary Xーray crystallographic studies of bovine heart mitochondrial cytochrome bc_1 complex." J.Mol.Biol.221. 379-382 (1991)

    • 関連する報告書
      1991 実績報告書

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公開日: 1991-04-01   更新日: 2016-04-21  

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