新しい甘味蛋白質(クルクリン及びマピンリン)の大量精製法の確立と活性部位の解明

• 研究課題/領域番号: 03556009
• 研究種目: 試験研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 応用生物化学・栄養化学
• 研究機関: 横浜国立大学
• 研究代表者: 栗原 良枝 横浜国立大学, 教育学部, 教授 (90017715)
• 研究分担者: 赤羽 丈明 旭電化工業(株), 開発研究所, 研究員 ; 大谷 裕之 横浜国立大学, 教育学部, 助手 (30213763) ; 栗原 堅三 北海道大学, 薬学部, 教授 (00016114) ; 中谷 一泰 昭和大学, 薬学部, 教授 (40053855) ; 山下 治之 旭電化工業(株), 研究員
• 研究期間 (年度): 1991 – 1993
• 研究課題ステータス: 完了 (1993年度)
• 配分額: 13,000千円 (直接経費: 13,000千円); 1993年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円); 1992年度: 3,500千円 (直接経費: 3,500千円); 1991年度: 7,400千円 (直接経費: 7,400千円)
• キーワード: 甘味タンパク質 / マビンリン / クルクリン / 耐熱性タンパク質 / アビンリン / 甘味蛋白質 / 甘味誘導蛋白質

研究概要

1.マピンリン同族体の精製法を確立した。中国雲南地方で採取した種子を石油エーテルで脱脂したのち、0.5M食塩水で抽出した。抽出液を硫安で塩析したのち、CM-セファロースカラムを用いて分画した。各画分をイオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過により、さらに精製した結果、5種類のマビンリン同族体(I-1,I-2、II,III,IV)を得ることに成功した。
2.免疫化学的手法により検討した結果、マビンリンIIの抗体と他の甘味タンパク質(モネリン、ソーマチン)および甘味誘導タンパク質(ミラクリン、クルクリン)との間には、交差反応がみられなかった。一方、マビンリンIIの抗体は、他のすべてのマビンリン同族体と交差反応を示した。
3.マビンリンの同族体の甘味活性の熱安定性を比較した。II、III、IVの活性は80℃で1時間加熱しても失活しなかったが、I-1のそれは失活した。
4.マビンリンI-1、III、IVの全一次構造を決定した。各同族体のアミノ酸配列順序には、高い相同性がみられた。とくに、I-1とIIIでは3個のアミノ酸が異なるだけであった。このうち1個はIVに存在しないし、もう1個はIIで置換がみられないので、残りの1個のアミノ酸残基(B鎖の47番目)が熱安定性に寄与していることが明らかになった。
5.マビンリン同族体のシステイン残基は、A鎖には2個、B鎖には6個存在し、これらはすべて同じ位置にあり、また、ジスルフィド結合の位置もすべて同じ位置に存在することを明らかにした。

研究成果

• [文献書誌] KURIHARA,Y & NIRASAWA,S: "Sweet,antisweet and sweetness-inducing substances" Trends in Food Science and Technology. 5. 37-42 (1994)
• [文献書誌] NIRASAWA,S et al.: "Disulfide bridge structure of the heat-stable protein,mabinlin II" Biochim.Biophys.Acta. 1202. 277-280 (1993)
• [文献書誌] 栗原 良枝: "甘味誘導タンパク質(ミラクリンおよびクルクリン)の遺伝子工学的研究," 化学と工業,. 46. 791-794 (1993)
• [文献書誌] LUI,X et al.: "Purification,complete amino acid sequence and structural characterization of the heat-stable sweet protein,mabinlin II" Eur.J.Biochem.211. 281-287 (1993)
• [文献書誌] HARADA,S.et al.: "Crystallization and Preliminary X-ray Diffraction studies of Curculin" J.Mol.Biol.238 in press. (1994)
• [文献書誌] Liu X et al.: "Purification,complete amino acid sequence and structural characterization of the heat-stable sweet protein,mabinlin II" Eur.J.Biochem.211. 281-287 (1993)
• [文献書誌] Abe,K.et al.: "Molecular cloning of curculin,a novel taste-modifying protein with a sweet taste." Biochim.Biophys.Acta.1130. 232-234 (1992)
• [文献書誌] Kurihara,Y.: "Characteristics of antisweet substances,sweet proteins and sweet-inducing proteins" Critical Reviews in Food Science and Nutrition.32. 231-252 (1992)
• [文献書誌] Nakajo,S.et al: "An enzyme immunoassay and immunoblot analysis for curculin,a new type of taste-modifying protein:Cross-reactivity of curculin and miraculin to both antibodies." Biochim.Biophys.Acta.1118. 293-297 (1992)
• [文献書誌] Kurihara,Y.: "Structures and functions of taste modifiers and sweet proteins." ¨Natural Resources and Human-Health¨edited by S.Baba Elsevier.147-156 (1992)
• [文献書誌] Igeta,H.et al: "Determination of disulfide array and subunit structure of taste-modifying protein,miraculin." Biochim.Biophys.Acta.1079. 303-307 (1991)
• [文献書誌] Abe,K.,et al.: "Molecular cloning of curculin,a novel taste-modifying protein with sweet taste," Biochim.Biophys.Acta,in press.(1992)
• [文献書誌] Nakajo,S.,et al.: "An enzyme immunoassay and immunoblot analysis for curculin,a new type of taste-modifying protein: Cross-reactivity of curculin and miraculin to both antibodies," Biochim.Biophys.Acta,. 1118. 293-297 (1992)
• [文献書誌] 栗原 良枝: "甘味タンパク質および甘味誘導タンパク質." 生化学. 63. 1340-1344 (1991)
• [文献書誌] Igeta,H.,et al.: "Determination of disulphide array and subunit structure of taste-modifying protein,miraculin," Biochim.Biophys.Acta,. 1079. 303-307 (1991)
• [文献書誌] Yamashita,H.,et al.: "Purification and complete amino acid sequence of a new type of sweet protein with taste-modifying activity,curculin," J.Biol.Chem.,. 265. 15770-15775 (1990)
• [文献書誌] Y.Kurihara: "Characteristics of proteins with sweet and/or taste-modifying protein," Critical Reviews in Food Sciences and Nutrition (CRC Press),. (1992)