| 研究課題/領域番号 |
03557013
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| 研究種目 |
試験研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
医化学一般
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
中澤 淳 山口大学, 医学部, 教授 (90025594)
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| 研究分担者 |
熊原 尋美 宇部興産株式会社, 宇部研究所, 課長
野間 隆文 山口大学, 医学部, 講師 (40189428)
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| 研究期間 (年度) |
1991 – 1992
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| 研究課題ステータス |
完了 (1992年度)
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| 配分額 *注記 |
6,000千円 (直接経費: 6,000千円)
1992年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
1991年度: 4,400千円 (直接経費: 4,400千円)
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| キーワード | プロモーター / ベクター / 培養細胞 / カテコール / C230 / ベペクター / プロモ-タ- / ベクタ- / カテュ-ル |
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| 研究概要 |
本研究ではメタピロカテカーゼ(C230)遺伝子の動物細胞での発現を検討するため、まず本遺伝子をSV40初期遺伝子プロモーターとエンハンサーの支施をうけるように配置したpSVKS230を作製した。これをHeLa細胞とCHO細胞に導入して培養後C230を測定したがその活性は認められなかった。そこで、次に効率よい発現が認められていてヒト伸長因子のプロモーターとエンハンサーの支施を受けるようにC230遺伝子を配置したプラスミドpEFKS230を作製したが、これも上記細胞での発現が認められなかった。さらに、動物細胞で効率よくタンパク合成が行われていることが知られている鶏アデニル酸キナーゼ1(AK1)のN末端部分にC230遺伝子をつないで融合遺伝子を作製し、これを上記pSVKS230とpEFKS230のC230遺伝子部分と置換してみたが、これらも動物細胞での発現を示さなかった。上記プラスミドは転写段階では十分機能していると考えられるので、C230遺伝子が動物細胞で発現しなかったのは専ら翻訳以後の過程に問題があるためと思われる。
本研究の過程で作製したpKS230はlacZプロモーターの下流にC230遺伝子を連結したもので、Hcic2またはEcoRVで切断しここに外来性DNAを挿入するとC230合成能が失われるので、プラスミド保持菌のコロニーは、カテユールを散布しても黄色を〓さなくなる。汎用されているXGnlを用いる方法に比して、このプラスミドの方が安価にDNAクローニングを行うことができる。このプラスミドにはT3やT7のプロモーターが存在するのでivtroRNA合成の鋳型として利用することができ、またDNA塩基配列決定のプライマーもデザインされているので、本研究の本来の目的からは外れるが、DNAクローン化のために有用なプラスミドであるといえる。
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