| 研究課題/領域番号 |
03557014
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| 研究種目 |
試験研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
医化学一般
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
山本 尚三 徳島大学, 医学部, 教授 (50025607)
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| 研究分担者 |
吉本 谷博 徳島大学, 医学部, 助教授 (60127876)
松本 隆志 日本たばこ産業株式, 生命科学研究所, 主席研究員
田辺 忠 国立循環器病センター研究所, 部長 (60025624)
清水 孝雄 東京大学, 医学部, 教授 (80127092)
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| 研究期間 (年度) |
1991 – 1992
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| 研究課題ステータス |
完了 (1992年度)
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| 配分額 *注記 |
15,000千円 (直接経費: 15,000千円)
1992年度: 5,500千円 (直接経費: 5,500千円)
1991年度: 9,500千円 (直接経費: 9,500千円)
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| キーワード | アラキドン酸 / シクロオキシゲナーゼ / トロンボキサンA合成酵素 / 12-リポキシゲナーゼ / 5-リポキシゲナーゼ / ロイコトリエンA水解酵素 / ロイコトリエンC合成酵素 / アラキドン酸カスケード / Arachidonic acid / Cyclooxygenase / Thromboxane A_2 Synthase / 12-Lipoxygenase / 5-Lipoxygenase / Leukotriene A_4 hydrolase / Leukotriene C_4 synthase / cDNA |
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| 研究概要 |
1)酵素のcDNAクローニング:以前にcDNAクローニングの終っているリポキシゲナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、ロイコトリエンA水解酵素に引続いて、平成3-4年度には、ヒトのシクロオキシゲナーゼcDNAを血小板(山本)ならびに血管内皮細胞(田辺)から、ヒトのトロンボキサンA合成酵素cDNAを血小板から(田辺)クローニングした。さらに、ロイコトリエンC合成酵素に対するモノクローン抗体を得て、それをプローブとしてλgtll系で酵素のcDNAクローニングを進めている(清水)。
2)酵素cDNAの発現:上記の種々のcDNAを発現させることが試みられた。5-リポキシゲナーゼは大腸菌と酵母(松本)、12-リポキシゲナーゼは大腸菌(吉本)、トロンボキサンA合成酵素はバキュロウイルス発現系を使って夜蛾幼虫株化Sf細胞(田辺)で、ロイコトリエンA水解酵素は発現方法を改良して、耐熱細胞Taqプロモータを使って大腸菌で発現させ、従来の5倍の収率で酵素を得た(清水)。
3)酵素mRNA定量法の開発:ヒト血小板12-リポキシゲナーゼcDNAをプローブとして、血小板中のこの酵素のmRNAを逆転写PCR法で増幅して、内部標準cRNAを基準として定量化する方法を開発し、白血病患者の血小板12-リポキシゲナーゼ低下症を検討した(山本)。
4)酵素免疫測定法の開発:抗酵素抗体を使って酵素蛋白量を特異的に感度よく定量する方法として、従来のシクロオキシゲナーゼやリポキシゲナーゼ(山本、吉本)に引続いて、ヒト血小板12-リポキシゲナーゼのペルオキシダーゼ共役の免疫測定法が開発され、上記の白血病患者の血小板に適用され(山本)、ロイコトリエンA水解酵素の酵素免疫測定法も設定された(清水)。さらに、cDNAクローニングで酵素のアミノ酸配列を知った上で、特異性の高い抗体を作ることが試みられ、ヒトのシクロオキシゲナーゼの460-475残基を認識する抗体を得た(田辺)。
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