| 研究課題/領域番号 |
03557033
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| 研究種目 |
試験研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
内科学一般
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
河盛 隆造 大阪大学, 医学部・第一内科, 講師 (00116021)
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| 研究分担者 |
渡会 隆夫 大阪大学, 医学部・附属病院第一内科, 助手
岩間 令道 大阪大学, 医学部・附属病院第一内科, 助手
森島 豊彦 大阪大学, 医学部・第一内科, 助手 (50221635)
山崎 義光 大阪大学, 医学部・第一内科, 助手 (40201834)
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| 研究期間 (年度) |
1991 – 1992
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| 研究課題ステータス |
完了 (1992年度)
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| 配分額 *注記 |
5,400千円 (直接経費: 5,400千円)
1992年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
1991年度: 4,300千円 (直接経費: 4,300千円)
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| キーワード | インスリン免疫センサ / 自己燐酸化 / インスリンEGFキメラ受容体 / インスリン / EGF / キメラ / 燐酸化 |
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| 研究概要 |
インスリンレセプターCDNAとEGFVレセプターCDNAを、合成DNAを用いて膜貫通部の細胞外領域で結合させ、その上流側にSV40earlyPromoterを接合した。さらに、大腸菌中での選択、増幅のためにpuc12に組込み、インスリン・EGFキメラレセプター発現プラスミドを作成した。このconstructを燐酸カルシウム法によりcos-7細胞にtransfectし、48時間後の細胞からインスリン・EGFキメラレセプターをWGAカラムを用いて半精製した。種々の濃度のインスリン添加後、^3^2P-ATPを用いてキメラレセプターの自己燐酸化能を解折、用量依存性の有無を検討した。
その結果、SDS-PAGE上、分子量約120KDa及び95KDaの位置に^3^2Pの取り込みが認められた。インスリンレセプターβサブユニットは分子量95KDaの位置に認められることから、後者はCOS-7が本来有しているインスリンレセプターβサブユニットであり、前者は理論上椎定されるインスリン・EGFキメラレセプターβサブユニットの分子量に相当し、COS-7細胞内で発現したインスリン・EGFキメラレセプターであると椎定された。
インスリンレセプター及びインスリン・EGFキメラレセプター共に、インスリン濃度0〜77nMの範囲内において、インスリン濃度に依存して^3^2P-A-TPの分子内への取り込みが認められたが、インスリン・EGFキメラレセプターでは、インスリンレセプターに比し自己燐酸化能は強かった。インスリン抗体を用いたインスリン免疫センサの測定可能領域(70nM以上)に比し、今回の測定系では7nMから77nMという、より低濃度のインスリンに反応し得る系を確立し、今後の臨床応用への道を開いた。キメラレセプターの接合部位を変えることにより、より感度の高いインスリン・EGFキメラレセプターを選択し、さらに純度の高いキメラレセプター蛋白を大量に発現させる等の改良を加えることによって、将来、本センサを臨床応用することが可能であると考られた。
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