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アルコ-ル発酵性細菌であるZymomonas mobilisはユニ-クな糖代謝系を有しており、そのために酸母よりも優れたアルコ-ル生産性を示す。本研究では、Z.mobilisに見いだした糖転移酵素、フルクトシルトランスフェラ-ゼ(FTase)や糖酸化還元酵素、グルコ-ス・フルクト-スオキシドレダクタ-ゼ(GFORase)を利用した機能性糖質化合物合成を目的とした。本年度は、FTaseによるオリゴ糖合成の検討、およびFTaseの糖転移反応改変のためのFTase遺伝子のクロ-ニングを行った。以下に、研究成果をまとめる。
1)FTaseの反応特性:FTaseをZ.mobilisの粗酵素液より硫安分画、DEAEーToyopearl、Toyopearl HW55カラムクロマトグラフィ-の後に、硫安を添加することにより、結晶状に単離した。得られた結晶標品を用いて物理化学的および酵素化学的性質を明らかにした。また、FTaseが広い糖転移受容体特異性を示すことから、ヘテロフルクトオリゴ糖合成の触媒素子として利用できるを明らかにした。
2)FTase遺伝子のクロ-ニング:エドマン分解により決定したFTーase Nー末端アミノ酸20残基の配列をもとに塩基配列を推定してオリゴヌクレオチドプロ-ブを合成した。次に、Z.mobilisのゲノムライブラリ-より、合成オリゴヌクレオチドをプロ-ブとしたDNAーDNAハイブリダイゼ-ション法によりFTase遺伝子を担う約3.4kbーCNA断片を分離した。
3)FTase遺伝子の解析:約3.4kbーDNA断片の全塩基配列を決定した。その結果、FTase遺伝子と推定されるアミノ酸424残基からなる1269bpsのオ-プンリ-ディングフレ-ムを見いだした。塩基配列より推定したNー末端アミノ酸配列はFTase酵素タンパクの分析値と一致した。
現在、FTaseの糖転移反応機構の解析と改変を目的として、FTase遺伝子への部位への部位特異的変異導入を検討している。
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