| 研究課題/領域番号 |
03670121
|
|---|
| 研究種目 |
一般研究(C)
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 研究分野 |
医化学一般
|
|---|
| 研究機関 | 岐阜大学 |
|---|
研究代表者 |
岡野 幸雄 岐阜大学, 医学部, 助教授 (10177066)
|
|---|
| 研究分担者 |
坂野 喜子 岐阜大学, 医学部, 助手 (50116852)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
1991 – 1992
|
| 研究課題ステータス |
完了 (1992年度)
|
| 配分額 *注記 |
2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
1992年度: 600千円 (直接経費: 600千円)
1991年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
|
|---|
| キーワード | ジアルグリセロール / イノシトールトリスリン酸 / ホスホリパーゼ-Cγ / チロシンキナーゼ / 肝細胞増殖因子(HGF) / HepG2細胞 / アラキドン酸遊離 / ジアシルグリセロール / ホスホリパーゼCν / ホスホリパ-ゼC / ジアシルグリセロ-ル / カルシウムイオン / チロシンキナ-ゼ |
|---|
| 研究概要 |
1.Fura-2標識および[^3H]アラキドン酸標識ヒト巨核芽球CMK細胞のトロンビン・トロンボキサンA_2アナログ(STA_2)刺激により細胞内Ca^<2+>が一過性に上昇し、著明なアラキドン酸遊離を認めた。ホルボールエステル(PMA)単独では有意の遊離はないが、前処理によって刺激に伴う遊離が相乗的に促進された。
2.トロンビン刺激CMK細胞のジアシルグリセロール(DG)を定量すると刺激後10秒および5分でピークを示す2相性DG産生を認めた。[^3H]ミリスチン酸標識細胞の刺激によりホスファチジルエタノールの産生を認め、2相目のDGがホスホリパーゼD経路で産生さるれことが示唆された。なお、PMAでCMK細胞を処理しその分化誘導を試みたが、再現性あるデータを得ることが因難であった。
3.ラット巨核球cDNAライブラリーをニワトリv-src cDNAをプローブとしてスクリーニングし、チロシンキナーゼをコードする8種の陽性クローンを得た。ラットhck cDNAをクローン化し、その全塩基配列を決定した。1911塩基対からなるラットhckは、503アミノ酸をコードし、分子量57,126と推定された。
4.CMK細胞の分化誘導が再現性に乏しいため、すでに分化した細胞としてラットの初代培養肝細胞を、未分化な細胞モデルとしてヒト肝癌細胞(HepG2)(正常肝細胞とほぼ同等にHGF受容体を発現)を肝細胞増殖因子(HGF)で刺激し、ホスホリパーゼC(PLC)とくにγ型サブタイプの活性化機構について検討した。1)ラット正常肝細胞をHGFで刺激するとイノシトールトリスリン酸(IP_3)が有意に産生されたが、癌化HepG2細胞では有意な産生を認めなかった。さらに、チロシンキナーゼ(PTK)阻害剤ゲニステインで予め処理した細胞の刺激に伴うIP_3産生は抑制された。また、[^3H]イノシトール標識した両細胞系でも同様の結果が得られた。HGF受容体が内因性PTK活性を有するプロト型癌遺伝子産物c-metであることから、刺激に伴うIP_3産生が受容体PTKを介したPLCの活性化によるものと考えられた。2)HGF刺激細胞の抗PLCγ抗体を用いた免疫沈降により、正常肝細胞ではPLCγのチロシンリン酸化を認めたが、癌化HepG2細胞では刺激に伴う変化を認めなかった。正常肝細胞のPLCγのチロシンリン酸化はゲニステイン前処理によって阻害され、HGF刺激に伴うPLCγのチロシンリン酸化は受容体PTKを介したものと考えられた。また、HGF受容体の発現の程度は、癌化HepG2細胞における受容体-PLCγ間のシグナル伝達異常が強く示唆された。
|
