| 研究概要 |
アミノ基転移酵素であるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼは,酸性側鎖を持アミノ酸(アスパラギン酸,グルタミン酸)と中性側鎖を持つアミノ酸(例えば,メチオニン,フェニルアラニン)の間のアミノ基転移反応を触媒する。従来の「一基質一酵素」の考え方からすると性質の異なった2つの基質結合ポケットが存在するのは奇妙に思われるが,アミノ基転移酵素のように異なったアミノ酸基質の間でアミノ基転移を行う酵素の場合にはこの方が都合が良いと思われる。今までに,基質特異性が低く何種類かの基質に作用する酵素は知られているが,アミノ基転移酵素のように2種類の基質に対してそれぞれ高い特異性を示す酵素は今までほとんど知られていない。これら2つのポケットの立体構造を明らかにする目的で,まず,酵素と酸性基質との複合体についてX線結晶解析を行ったところ,酸性基質側鎖のCOO^-はArg292と静電的相互作用をする事が明らかになった。次に,酵素と中性基質との複合体のX線結晶解析も試みたが,まだ成功していない。そこで,コンピューターグラフィックスを用いて,2箇所の中性基質結合部位を予測した。いずれが中性基質結合部位かを確かめるために,予測された2箇所のポケットに存在するアミノ酸約15残基を遺伝子操作法で置換した。得られた変異型酵素を量産化し,酸性基質および中性基質との反応性を,ストップトフロー法などの分光学的方法で解析した。しかし,いずれのポケットも中性基質は結合しないことが示唆された。そこで,大腸菌の相同的組換え法を利用してキメラ酵素を作製し,酵素分子全体を広くスクリーニングして中性基質結合部位を検索した。その結果,中性基質の結合には活性部位から離れた部位も関与することが示唆された。
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