| 研究課題/領域番号 |
03670498
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
小児科学
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
吉本 雅昭 長崎大学, 医学部, 講師 (70167021)
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| 研究分担者 |
松本 正 長崎大学, 医学部, 講師 (70190535)
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| 研究期間 (年度) |
1991
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| 研究課題ステータス |
完了 (1991年度)
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| 配分額 *注記 |
2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
1991年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
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| キーワード | 21ー水酸化酵素欠損症 / PCR / DGGE / SSCP / 家系診断 |
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| 研究概要 |
1)家系員のDNA抽出;集積した25家系の家系員の末梢白血球よりDNAを抽出し保存した。
2)プライマ-の作成;21ー水酸化酵素B遺伝子(21ーOHB)内に計12組、24種類のPCR用プライマ-を作成した。このうち6組は21ーOHBのみを増幅する組合せであり、かつ21ーOHBの全遺伝子領域を増幅可能な組合せである。
3)PCR法によるDNA増幅;(1)発端者の検索;25名の発端者において21ーOHB遺伝子の第3ー5エクソンを増幅するプライマ-を用いて増幅し(480塩基長DNA断片)、6名に遺伝子欠失パタ-ンを検出した。この6家系では次子の胎児診断は容易である。(2)家系員の検系;25家系の両親、同胞、19名の発端者から(1)と同じDNA領域を増幅して保存した。
4)DGGE法による解析;発端者が欠失パタ-ンを示さない5家系の家系員をDGGE法により点変異の有無を検討した。2家系で両親のいずれかが2個のalleleの泳動パタ-ンが異なり、連鎖解析が可能であった。しかし増幅DNA断片が480bpと比較的長いため、長時間の電気泳動を必要とする。両親のalleleが区別できなかった1家系に於て一方のプライマ-に30bpのGCを接続するGCーclumped DGGE法を施行し父でalleleの区別が可能であったが、やはり長時間の泳動を要した。
5)SSCP法による解析;より簡便な診断法を確立するためPCRーSSCP銀染色法を施行した。3)ー(1)の480bp断片は制限酵素PvuIIで切断すると360bpと120bpの平滑末端を有する2個の断片に分かれる。PCR産物をPvuII消化後SSCPー銀染色を行うことにより、4種のalleleを同時に検索可能であり、かつ4時間の電気泳動で十分であった。6家系の両親・発端者での検討では、両親の計4個のalleleのうち少なくとも1個のalleleは全家系で区別可能であった。この方法は非常に簡便であり、放射線被爆はなく、かつ効率の良い方法である。
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