| 研究課題/領域番号 |
03670708
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
整形外科学
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| 研究機関 | 大分医科大学 |
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研究代表者 |
真角 昭吾 大分医科大学, 医学部, 教授 (50050373)
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| 研究分担者 |
中村 道利 大分医科大学, 医学部, 講師 (00145385)
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| 研究期間 (年度) |
1991
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| 研究課題ステータス |
完了 (1991年度)
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| 配分額 *注記 |
2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
1991年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
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| キーワード | 骨形成不全症 / タイプIIコラ-ゲン / 制限酵素多型 / 非RI検出法 |
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| 研究概要 |
骨形成不全症患者のコラ-ゲン遺伝子に一部変異を認める、という外国での報告がある。これを確認するため、まず日本人での標準を求める作業から開始した。具体的には、献血者から得られた白血球成分液138人分につき、そのゲノムDNAを精製して準備した。制限酵素で切断して電気泳動してみると、うち13人分は不適当と判断され、125人分についてその制御酵素多型(RFLP:Restriction enzyme Fragment Lengths Polymorphysm)を討することとした。一方、この遺伝子異常をみる、という作業は診断のための臨床検査に近い意味も持つため、従来使われてきたラジオアイソト-プを用いる方法に替えて、ラジオアイソト-プを使わない方向(non‐RI genomic Southern)に向かいつつあることをふまえ、non‐RIでの検出を試みることとした。
現在使えるnon‐RIでの検出法は数種類あり、このうちAmersham社のECL法(化学ルミネセンス法)、Boehringer Mannheim社のDIG法(ジゴキシゲニン抗体法)、BRL社のPhtoGene法(アビジンービオチン系法)の三法を試みた。いずれもnon‐RIで検出用として市販されているが、実際に試してみると直ちに結果が得られるほど確立した方法ではないことがわかった。いずれもフィルタ-の選定や洗浄条件等の細かな決定が必要であり、これによって検出感度の大幅な変化がみられた。おそらく各検出試薬のロットによる差も大きいと考えられるが、その検定まではできなかった。
供与されたプロ-ブはプラスミドpBR322に組み込まれていたので、これをpUC19ついでpUC119にサブクロ-ニングしてssDNAとして用い、Amersham社のECL法と組み合わせて方法論まで確立し、現在日本人での標準を求める作業を実施中である。
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