| 研究概要 |
リソゾ-ム膜より,Mono Qカラム及びTSKーgel G4000SW_<XL>を用いてH^+ーATPaseを精製することに成功した。本酵素はSDSーPAGEで空胞系H^+ーATPーaseに共通にみられる(110),70,56,42,39,34,16kDaのサブユニット構造を示した。至適pHは7.0ー8.0、ATPに対するKm値は0.095mM、基質特異性はATP,dATP>GTP,ITP>UTPで、CTP,AMP,cAMPは無効,ADPは阻害した。二価金属要求性はMg^<2+>,Mn^<2+>>Fe^<2+>,Co^<2+>>Ca^<2+>で,Sr^<2+>,Ba^<2+>は無効、Cu^<2+>,Pb^<2+>,Zn^<2+>,Hg^<2+>,Cd^<2+>,Ni^<2+>は阻害した。Cl^ー,Br^ー,F^ーが活性化し、NO_3^ーは強く阻害した。bafilomycin A_1の他、NEM,NBDーCl,DCCSに感受性であった。また,16kDaサブユニットに対するcDNAの単離,抗16kDa抗体の調製にも成功,これらプロ-ブを用いた検討の結果,16kDa蛋白は腎臓と脳で極めて発現が高いこと,その遺伝子は複数存在することを明らかにできた。単クロ-ン抗体も調製できたが,インムノブロットには成功していない。更に,可溶化H^+ーATPaseを希釈法でリポソ-ムに組み込み,プロトン・ポンプ再構成に成功した。この過程で,リソゾ-ム膜上にK^+及びCl^ーに対するイオンチャンネルが存在することを示唆する結果を得た。
H^+ーATPase以外の2種のATPaseについてもその性質を明らかにした。ATPaseII(360kDa)と類似のATPaseは,細胞膜上にectoーATPsaeとして存在する。両ATPaseを単離して比較した結果,至適pHとCa^<2+>/Mg^<2+>要求性が若干異なるものの,その他の性質(二価金属要求性,基質特異性,薬剤感受性<酸性でバナジン酸感受性>等)は両酵素で極めて類似していることが確認された。NEM感受性のATPaseI(550kDa)は,ATPaseII共々リゾソ-ムの内部に存在することが判明,顆粒の細胞内運動に関係したキネシンや膜融合に関与するNSFとの関係は否定された。
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