| 研究課題/領域番号 |
03680147
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
物質生物化学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
小堤 保則 京都大学, 薬学部, 助手 (70205425)
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| 研究分担者 |
岡 昌吾 京都大学, 薬学部, 助手 (60233300)
川嵜 敏祐 京都大学, 薬学部, 教授 (50025706)
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| 研究期間 (年度) |
1991 – 1992
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| 研究課題ステータス |
完了 (1992年度)
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| 配分額 *注記 |
1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
1992年度: 500千円 (直接経費: 500千円)
1991年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
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| キーワード | 西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP) / イナゴ / 昆虫神経細胞 / 糖鎖 / ピリジルアミノ化 / 昆虫 / 神経細胞 / 西洋ワサビペルオキシダ-ゼ(HRP) / マンノ-ス / コンカナバリンA / アフィニティ-カラム |
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| 研究概要 |
西洋ワサビペルオキシダーゼに対する抗体(anti-HRP)はイナゴを含む昆虫の神経系に特異的に存在する糖鎖を認識することが知られている。黒坂らは既にanti-HRPと反応性を示す糖鎖をHRPより単離し、その構造を決定している(Manα1→6(Manα1→3)(Xy1β1→2)Manβ1→4G1cNAcβ1→4(Fucα1→3)G1cNAc)。本研究では実際に昆虫の神経細胞に発現している糖鎖がHRPの糖鎖と同じかどうかを明らかにする目的で、イナゴ頭部よりanti-HRPと反応性を示す糖タンパク質を精製し、その性質を検討した。
イナゴ頭部をクロロホルム/メタノール(2:1)で脱脂した後、0.9%NaC1を含むリン酸緩衝液で抽出した。抽出物を硫安分画し活性の最も多く含まれていたの20-80%沈殿画分を用いて実験を行った。この画分をまずコンカナバリンA、レンチルを用いたレクチンアフィニティークロマトフラフィーを行なったところ、活性はいずれも結合した。この結合した画分をさらにpheny15PWを用いたHPLCにより分画し、anti-HRPと反応性を示す糖タンパク質を精製した。anti-HRPと反応性を示す糖タンパク質の検出には、HRPの糖鎖を固定化したウェルを用いたELISA法によって行なった。精製した糖タンパク質の糖組成はマンノース、N-アセチルグルコサミン、フコースが主成分でありHRPに存在していたキシロースはみられなかった。また、α-マンノシダーゼ消化することによりanti-HRPとの反応性が消失したことから、エピトープとしてα-結合のマンノース残基の存在が示唆された。さらにこの糖タンパク質に含まれる糖鎖の構造を解析するために、精製した糖タンパク質をヒドラジン分解後、遊離した糖鎖をピリジルアミノ化(PA化)した。このPA化糖鎖を、逆相カラム、アミノカラムを用いた2次元マッピングにより糖鎖構造の推定を行なった。
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