| 研究課題/領域番号 |
03680172
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
代謝生物化学
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| 研究機関 | 高知大学 |
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研究代表者 |
味園 春雄 高知大学, 農学部, 教授 (30027073)
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| 研究分担者 |
永田 信治 高知大学, 農学部, 助教授 (60180494)
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| 研究期間 (年度) |
1991 – 1992
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| 研究課題ステータス |
完了 (1992年度)
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| 配分額 *注記 |
1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
1992年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
1991年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
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| キーワード | リジン脱水素酵素 / 化学修飾 / クローニング / 遺伝子の塩基配列 / アミノ酸配列 / 一次構造 / クロ-ニング |
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| 研究概要 |
リジン脱水素酵素は、基質リジンによって二量体から四量体に会合して、活性化されるユニークなアロステリック酵素であり、触媒部位のほかにエフェクター結合部位が存在している。この触媒部位、エフェクター結合部位のアミノ酸残基を明らかにするために、種々の試薬による化学修飾を行った。その結果、触媒部位にアルギニン残基、トリプトファン残基の存在が、エフェクター結合部位にリジン残基、システイン残基の存在が示唆された。またAgrobacterium tumefaciensはTiプラスミドを含んでいるが、本酵素の構造遺伝子はTiプラスミド上にはコードされていなかった。そこで、本菌株の全DNAをHindIIIで部分消化し、ベクターとしてpUC18を用いてE.coli JM109にショットガン法でクローニングを行い、4,000株の組み換え体の中から1株の本酵素活性を有するクローン株を得た。この組み換え体より得られたプラスミドpKUKD19はpUC18のHindIIIサイトに約3.5kbのHindIII断片を含んでおり、これをさらにサブクローン化して、本酵素遺伝子を含む約1.3kbのSspI-XhoI断片を含むpKUKD19-4を構築した。また、SspI-XhoI断片を高発現ベクターpKK223-3のtacプロモーターの下流に挿入することによってpKUKD19-5を調製し、本酵素遺伝子の高発現株を得た。このSspI-XhoI断片の塩基配列を解析した結果、1074塩基からなるオープンリディグフレームを見い出し、本酵素の一次構造を推定した。357残基からなるアミノ酸配列は、ペプチドのN-末端22残基、C-末端2残基のアミノ酸配列と一致した。NAD結合領域はN-末端側に、触媒領域はC-末端側にあること、さらに、本酵素には、他の脱水素酵素で重要な働きをしている触媒部位のG-G-G-K配列のリジン残基は認められず、ピリドキサル燐酸で修飾されたリジン残基はエフェクター結合領域に存在していることが推察された。
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