| 研究概要 |
T3ファ-ジの精製in vitro DNA詰込み系は線状DNAを同調的に頭殼内へ詰込む。詰込まれたDNAはDNaseで消化されないので,詰込み反応開始後,経時的に反応液をDNase処理すると,DNAに段階的欠損を導入出来る。このT3ファ-ジ精製in vitro系を用いて,長大DNAに段階的欠損を導入して構造を解析する方法を確立することを目指した。COS配列の両側に異なった薬剤耐性遺伝子(Cm^r,Amp^r)と複製起点(oriーI,oriー2)及びクロ-ニング座位をもつプラスミドベクタ-を構築し,ヒトDNA断片(25kb)を挿入後,入タ-ミナ-ゼによりcos座位で切断,線状化して詰込みの 基質に用いた。反応開始後3,7及び10分にDNase処理し,環状化して得たプラスミドを用いてE.coliを形質転換し,それぞれの薬剤で選択し,形質転換細胞からプラスミドDNAを調整した。制限酵素Pst Iで切断して,DNAの分子量を逑めると,Ampで選択した場合,分子量22kbを最長とする種々の長さのDNAが得られ,その制限酵素地図を決定出来た。Cmで選択すると,10kb以上のDNAを得ることは出来なかった。逆方向に挿入された同一ヒトDNA断片をもつクロ-ンを用いて,Cm選択による実験を行なったところ,22kb DNAを得たが,Amp選択では10kb DNAしか得られなかった。得られた欠失プラスミドDNAの塩基配列を決め,最初に詰込まれたDNA端(COS配列)はDNaseにより消化されていないことが確認出来た。
T3ファ-ジin vitro DNA詰込み系を用いると,容易に長大DNAの制限酵素地図を構築出来ることが判った。それぞれの制限酵素DNA断片について種々の欠失の入ったセットを得ることが出来るので,塩基配列も決定出来るはずである。今回,はからずも示されたように,用いるDNAによりクロ-ニングの困難な場合がある。DNA詰込み反応以降の諸条件し環状化,形質転換等)の検討が必要である。
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