| 研究概要 |
NδFはハプテン(低分子感作性物質)の投与によって脾臓に誘導された抑制性マクロファ-ジから産生される分子量56kDaのサイトカインである。NSFは遅延型過敏症の発現を非特異的かつほぼ完全に抑制する。本年度はこの抑制性マクロファ-ジからNsFのmRNAを抽出しそのcDNAのクロ-ニングを目ざし次の実験を行った。(1)、mRNAの抽出;ファ-ストトラック(インビトロ-ゲンのmRNA抽出用キット)を用いて、精製したプラスチック付着性の抑制性マクロファ-ジからmRNAを抽出した。数回の作業を繰り返すことによってcDNAのクロ-ニングに十分な量(14.5μg)のmRNAを抽出することができた。(2)、cDNAのライブラリ-からポジティブクロ-ンを拾うためのスクリ-ニング系の確立;目的とするcDNAのクロ-ンを拾うには、NSFのN末端のアミノ酸配列を知り,それに対応するDNAのプロ-ブを合成するのが確実である。NSFの精製方法を一応確立していたため,NSFを含む培養上清から、DEAEーセファセル,セファデックスGー100,逆相高速液クロでNSFを精製し、SDS電気泳動にかけ目的とするバンドを含むゲルから蛋白を溶出させプロテインシ-ケンサ-にかけたが,ノイズが多くN末端のアミノ酸配列を読み取ることができなかった。そのため再度精製方法の改良を試みた。その結果、グリ-ンA(アフィニティの一種)で極めて選択性の高い精製を行なえることが判明した。現在はこの精製方法を加え、NSFの高度の精製品を準備し、プロテインシ-ケンサ-にかけるべくサンプルを集めている。
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