| 研究概要 |
酵母の小胞体からゴルジ体への小胞輸送には,Sar1pという低分子量GTP結合タンパク質が必須である.このSar1pの機能を解明していくために,無細胞輸送系による解析を進めた.
昨年度に開発した小胞体よりの輸送小胞形成のアッセイに加え,一旦細胞質に放出された輸送小胞を分離・精製し,再びゴルジ体を含む膜系に戻すことによってゴルジ体へのターゲティング反応を試験管内で再構成することに成功した.このチェイス反応では,sec12ts変異の影響は見られず,Sec12pが小胞の形成反応に特異的に機能していることが示唆された.また,Sar1pに対するGAP活性をもつSEC23遺伝子の変異では,小胞の形成活性は完全には失われておらず,さらにSar1pの添加によってその損傷が抑圧された.われわれは,昨年度に,Sar1p・GTPγSを用いた実験から,Sar1pによるGTPの水解は輸送小胞の形成以降に必要であるというモデルを提唱しているが,上記の実験事実はさらにこれを強く支持するものである.
in vitro mutagenesisによって,これまでに変異型Sar1pをいくつか作成しているが,大腸菌の発現系を用いて,タンパク質の精製法を確立した.現在までに,劣性の温度感受性を示すもの,および優性致死の性質を示すもののいくつかについて,精製標品を得ることができたので,それぞれのGTP結合能,GTPase活性,およびin vitro輸送活性を検討中である.また.劣性変異については,染色体上に組込ませることによって安定な変異株を作成し,in vivoでの解析を進める一方,その変異を抑圧する新しい遺伝子のスクリーニングも開始している.
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