| 研究課題/領域番号 |
03833026
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
分子細胞生物学
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| 研究機関 | 佐賀医科大学 |
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研究代表者 |
小池 達郎 佐賀医科大学, 医学部, 教授 (80128131)
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| 研究分担者 |
田中 秀逸 佐賀医科大学, 医学部, 教務員 (90202431)
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| 研究期間 (年度) |
1991 – 1992
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| 研究課題ステータス |
完了 (1992年度)
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| 配分額 *注記 |
1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
1992年度: 400千円 (直接経費: 400千円)
1991年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
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| キーワード | 細胞死 / 神経栄養因子 / 脱分極 / PC12細胞 / カスケード / 小脳 / 交感神経節 / 神経成長因子 / 分子生物学 / プロトオンコジン / PC12 / シクロヘキシミド |
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| 研究概要 |
1.神経栄養因子除去による神経細胞の細胞死に伴い活性化されるカスケードの同定
細胞死に関連した物質(DAPS)を同定するためには、現在の技術では多量に試料を調製する必要がある。この為、分化したPC12細胞及び小脳granule細胞を用いた。生後7日目のラット小脳から単離したgranule細胞は培養5日目には全て死に、この過程は蛋白質合成阻害等で抑えられるactiveな過程であった。又、脱分極すると細胞死は防げることが判った(3年度)。この栄養因子欠乏による細胞死における情報伝達系を調べる為、クローニングを行った。シクロヘキシミド-マイナス(細胞死の起こる)及びプラス(細胞は死なない)の条件下で細胞を培養し、それらの細胞から抽出したmRNAからcDNA Libraryをラムダベクターを用いて作成した(4年度)。更に両者のSubtracted Libraryを作成する試みを行っている。このSuBtractionが十分うまくいっているとはいいがたく、他の方法の模索も進めている。
2.NGF除去により引き起こされるカスケードの過程とその阻止機構の解析
ラット新生胎児の上頸神経節から得られた細胞とNGF処理したPC12細胞でNGF除去により引き起こされる細胞死は相同なカスケードを取ることが判った(3年度)。そこで、NGF除去後経時的に、PC12細胞を可溶化,SDS-PAGE,蛋白質の転写膜の作成を行い、抗phosphotyrosine抗体を用いてWestern Blotを行ったところ、4つの主要なチロシン燐酸化蛋白質に脱燐酸化が起こることが判った(4年度)。一方SDS-PAGE後の転写膜を用いてkinase活性をrenaturationし自己燐酸化能を調べたところ、NGF除去に伴い主要な燐酸化活性が徐々に減少していた。これらの脱燐酸化カスケードが直接細胞死を導くのか不明であるが、この反応過程はCHXやACD処理で遅れることから、なんらかの制御された過程であると思われる。又、この細胞死カスケードを阻止する機構として脱分極による選択的チロシン燐酸化を見いだしている(4年度)。この蛋白質の同定を分子生物学的手法で進めている。
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