| 研究課題/領域番号 |
03J05604
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| 研究種目 |
特別研究員奨励費
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 国内 |
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| 研究分野 |
医薬分子機能学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
白石 泰久 京都大学, 薬学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
2,700千円 (直接経費: 2,700千円)
2005年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
2004年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
2003年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
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| キーワード | 亜鉛フィンガー / ヒンジヘリックス / Sp1 / GLI / 塩基認識 / リンカー / β-シート |
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| 研究概要 |
Lac repressor内のヒンジヘリックスは、DNAの副溝結合能、2量体形成能、DNA湾曲能といった亜鉛フィンガータンパク質に見られないユニークな機能を有することから、この機能ドメインを亜鉛フィンガータンパク質に組込むことで、亜鉛フィンガータンパク質の機能拡張や医学的な応用において、大きな可能性を与えることが期待される。これまでに私が遂行してきた亜鉛フィンガータンパク質の構造・活性相関に関する研究成果に加え、亜鉛フィンガータンパク質のリンカー領域がDNAの副溝に近接することを考慮して、亜鉛フィンガードメインを連結するリンカー領域にヒンジヘリックスを組込むことにした。
亜鉛フィンガータンパク質としては、構造面並びに機能面での知見が豊富なヒト由来のSp1亜鉛フィンガーを選択した。この亜鉛フィンガータンパク質のC末端側にヒンジヘリックスを融合することにし、その際、亜鉛フィンガードメインによる構造面での影響を排除するために、グリシン残基を挿入することにした。基質DNAとしては、2量体形成を考慮して、2つの結合サイトを対称に配置したものを用意した。
このタンパク質は、大腸菌体内で発現させ、陽イオン交換とゲルろ過を組み合わせることで精製した。DNA結合親和性への影響について、ゲルシフト法により評価を行った。その結果、2量体形成に伴う結合親和性の相乗的な向上は見られなかった。今後さらなる基質DNAの最適化が必要と考えられる。一方で、ヒンジヘリックスと平行して、金属結合型ペプチドを挿入した変異体では、新規なDNA切断活性を示すことを明らかにした。以上の研究成果は、今後の亜鉛フィンガータンパク質の高機能化や応用研究において、有用な知見を与えてくれるものであると考えられる。
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