時分割X線結晶解析によるグルタチオン合成酵素の動的構造研究

• 研究課題/領域番号: 04044103
• 研究種目: 国際学術研究
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 共同研究
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 勝部 幸輝 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (20032013)
• 研究分担者: HAJDU J. オックスフォード大学, 分子生物学科, 講師 ; PETSKO G. ブランダイス大学, 基礎医学研究センター, 教授 ; 加藤 博章 京都大学, 化学研究所, 助手 (90204487) ; 畑 安雄 京都大学, 化学研究所, 助教授 (10127277) ; 西岡 孝明 京都大学, 化学研究所, 助教授 (80026559) ; 小田 順一 京都大学, 化学研究所, 教授 (50027041) ; 勝部 幸輝 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (20032013) ; HAJDU Janos Laboratory of Molecular Biophysics, Oxford University ; PETSKO Gregory A. Basic Medical Sciences Research Center, Brandeis University ; KATUBE Yukiteru Institute for Protein Research, Osaka University ; J Hajdu 英国オックスフォード大学, 分子生物学科, 講師 ; G Petsko 米国ブランダイス大学, 基礎医科学研究センター, 教授
• 研究期間 (年度): 1992 – 1993
• 研究課題ステータス: 完了 (1993年度)
• 配分額: 8,100千円 (直接経費: 8,100千円); 1993年度: 4,100千円 (直接経費: 4,100千円); 1992年度: 4,000千円 (直接経費: 4,000千円)
• キーワード: 時間分割X線構造解析 / グルタチオン合成酵素 / 時間分割X線ラウエ法 / 蛋白質の動的構造 / 時間分割結晶構造解析 / ラウエ法 / 放射光 / フローセル / フラッシュ光反応 / 変異体酵素 / ATP

研究概要

1 本研究に用いた大腸菌のグルタチオン合成酵素は、アミノ酸残基315、分子量3650の等価な4つのサブユニットからなる4量体で、その立体構造は、本研究(X線結晶解析法)によって初めて明にされた。本酵素には基質結合部位付近に電子密度を与えないGly残基に富んだ17残基からなるフレキシブルなループ領域が存在し、このループが活性発現に重要であることが判明した。
2 本酵素の触媒反応における反応中間体生成過程の時間分割X線結晶解析を行なうため、次の(1)〜(2)の各項目について実験研究を行なった。(1)変異酵素の作成:時間分割測定のためには、結晶中で酵素反応が反射データ収集に要する時間よりもゆっくりと進行させなくてはならない。この条件を充たすため、本酵素の基質結合部位周辺部にある極性アミノ酸残基を他の残基に置換した変異体酵素を種々作成した。それらの反応動力学的定数を測定し、基質に対する高い親和性(1/Km)を維持したまま、触媒定数(kcat)が小さな変異体酵素を検索した。その結果、Arg210残基をLys残基で置換したR210Kを選抜した。またフレキシブルループを4つのGlyで置き換えた変異体酵素DELについても検討することにした。(2)結晶状態における酵素反応の検討:結晶状態でも酵素反応が進行することを確かめるため、R210K変異体酵素とcaged-ATP、γ-Glu-Cysの複合体結晶を作成した。cagedATPはフラッシュフォトリシスで、きわめて短時間で基質ATPを生成することから、光照射によって酵素反応を同調的に開始させることができることがわかった。また、結晶中でR210K変体酵素はきわめてゆっくりと(t1/2=55h)酵素反応が進行していることもわかった。また、フローセルを用いた方法についても同時に検討した。(3)ラウエ測定条件の検討:ラウエ測定法では、白色X線の照射による結晶の損傷や、結晶のモザイク性の増加による反射斑点のストリークができるだけ少なくなるような測定条件を選ばなくてはならない。測定は、米国ブルックヘブン研究所(station x-26c:focus<1.0mm,4-20kev)と、英国ダラスベリ-研究所(station 9.7:wiggler three pole 0.2-2.6A)で行なった。その結果、(1)変異体酵素DELの結晶は放射光に対してきわめて安定であること、(2)変異体酵素DELの結晶をセファデックス中に埋めて固定して(フローセル法)、ATP(50mM)とγ-Glu-Cys(50mM)を含む緩衝液をゆっくりと(約1ml/hr)流して結晶中に拡散させた場合、セファデックスのサイズが大きいと、また、結晶の厚さが薄いと回折斑点がストリークすること、などが判明した。このことから、フローセル法は、本研究目的に適しないことがわかった。(4)反応中の酵素結晶のラエウ測定:変異体酵素DELの結晶をフローセルに固定して基質溶液を流すと、基質溶液が結晶に到達してから約16-20分後にストリークがあらわれた。R210K変異体とcagedATP、γ-Glu-Cysの複合体結晶をキャピラリーを入れてフラッシュフォトリシスした場合にはストリークはそれほど顕著にあらわれなかった。(5)データ処理の検討:ラウエ法でのデータ処理は、共同研究者であるHajduが、本研究のために開発したLAUEGEN及びLEAPを用いた。その結果、R210Kのラウエ法によって5170の独立の回折斑点の強度データを得ることに成功した。これらの回折斑点を用いて得られた電子密度図は、主鎖及び側鎖を当てはめてモデリングを行なうことができる明瞭なものであった。
3 以上の結果、現状の時間分割X線結晶解析法では、10秒の時間分割で行なうことができることがわかった。これは、R210K変異酵素の結晶中での反応速度に比べて十分に短い時間である。したがって、グルタチオン合成酵素の時間分割X線結晶解析による動的構造研究に、R210Kを用いると、従来から指摘されていた同法の問題点を全てクリアすることができることが判明した。また、DEL変異酵素についても中間体生成過程の動的構造解析に利用し得ることも判明した。

研究成果

• [文献書誌] Hiroshi Yamaguchi,Hiroshi Kato,Yasuo Hata,Takaaki Nishioka,Akira Kimura Jun'ichi Oda,Yukiteru Katsube: "Three-dimensional Structure of Glutathione Synthetase from E.coli at 2.0 A Resolution" J.Mol.Biol.229. 1083-1100 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Takuji Tanaka,Hiroshi Yamaguchi,Hiroaki Kato,Takaaki Nishioka,Yukiteru Katsube,Jun'ichi Oda: "Flexibility Imparired by Mutantions Revealed the Multifunctional Roles of the Loop in Glutathione Synthetase" Biochemistry. 32. 12398-12404 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Takao Hibi,Hiroaki Kato,Takaaki Nishioka Jun'ichi Oda,Hiroshi Yamaguchi,Yukiteru Katsube,Katsuyuki Tanizawa,Toshio Fukui: "Use of Adenosine(5')polyphospho(5')pyridoxals to Study the Substrate-Binding Region of Glutathione Synthetase" Biochemistry. 32. 1548-1554 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Takaaki Nishioka,Yasuko Hara,Hiroaki Kato,Yasuo Hata,Hiroshi Yamaguchi,Yukiteri Katsube,Jun'ich Oda: "3D structrue of Ternary Complex of Glutathione Synthetase from E.coli B with ADP and Glutathione" Photon Factory Activity Report. 10. 102 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Hiroaki Kato,T.Tanaka,H,Yamaguchi,T.Hara,T.Nishioka,Y.Katusube,J.Oda: "Flexible Loop that is Novel Catalytic Machinary in a Ligase,Atomic Structure and Function of Loopless GSHase" Biochemistry. (in press). (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Hiroshi Yamaguchi, et al.: "Three-dimensional Structure of Glutathione Synthetase from E.coli at 2.0 A Resolution" J.Mol.Biol. 229. 1083-1100 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Takuji Tanaka, et al.: "Flexibility Imparired by Mutation Revealed the Multifunctional Roles of the Loop in Glutathione Synthetase" Biochemistry. 32. 12398-12404 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Takao Hibi, et al.: "Use of Adenosine(5')polyphospho(5')pyridoxals to Study the Substrate-Binding Region of Glutathione Synthetase" Biochemistry. 32. 1548-1554 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Takaaki Nishioka, et al.: "3D structure of Ternary Complex of Glutathione Synthetase from E.coli B with ADP and Glutathione" Photon Factory Activity Report. 10. 102 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Hiroaki Kato, et al.: "Flexible Loop that is Novel Catalytic Machinary in a Ligase, Atomic Structure and Function of Loopless GSHase" Biochemistry. (in press). (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Y.KATSUY,M.SATO,Y.KATSUBE,Y.MATSUURA,K.TOMODA: "Small-angle X-ray Scattering Study of Metal Jon-induced Canformational Changes in Serratice Protease" J.Biol.chem.267. 12668-12672 (1992)
• [文献書誌] M.SATO,M.YAMAMOTO,K.IMADA,Y.KATSUBE,N.TANAKA,T.HIGASHI: "A High-Speed Data-Collection System for Large-Unut Cell Crystals asing an Imaging Plate as a Detector" J.App.Cryst.25. 348-357 (1992)
• [文献書誌] M.SAKIRAI,K.ONODERA,H.MORIYAMA,O.MATSUMOTO,N.TANAKA,M.SATO,Y.KATSUBE,T.OSHIMA: "Crstallization and Preliminary X-ray Studies of A B.sicdtilis and T.ther mophilus HB8 Chimeric 3-IPMDH and Thermostable Mutants of It." J.Biochem.112. 173-174 (1992)
• [文献書誌] B.MIKAMI,M.SATO,T.SHIBATA,M.HIROSE,S.AIBARA,Y.KATSUBE,Y.MORITA: "Three-Dimensional Structure of Soybean β-Awy lase Determined at 3.0Å Resobution:Prelimiory Chaiu Tracing of the Couplex coith d-Cyclodextrin." J.Biochem.112. 541-546 (1992)
• [文献書誌] M.SATO,Y.KATSUBE,M.KATAI,J.KATAKAWA,T.TETSOMI: "Crystcal and Molecular Structare of 3,6-Dioxograyanotoxin I" Bull.Cheu.Soc,JAPAN. 65. 2836-2838 (1992)
• [文献書誌] H.YAMAGUCHI,H.KATO,Y.HATA,T.NISHIOKA,A.KIMURA,J.ODA,Y.KATSUBE: "Three-Dimensional Structure of the Glutathione Synthe Tase from E.coli Bat 2.0Å Resolution" J.Mol.Biol.230. -18 (1993)
• [文献書誌] C.Branden,J.Tooze著 監修 勝部幸輝.松原央.松原謙一 翻訳 勝部幸輝.竹中章郎.福山恵一.松原央: "タンパク質の構造入門(Introduction to Protein Structure)" 教育社, 285 (1992)