胚性幹細胞を利用した変異マウス株作製系の確率

• 研究課題/領域番号: 04044111
• 研究種目: 国際学術研究
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 共同研究
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 島田 和典 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (40037354)
• 研究分担者: COSTANTINI F コロンビア大学, 医学部, 教授 ; GOTTESMAN Ma コロンビア大学, 癌研究所, 所長 ; 前田 秀一郎 山梨医科大学, 医学部, 教授 (10117244) ; 西口 聖治 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (90237686) ; 城 忠志 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (50243259) ; 瀧原 義宏 大阪大学, 微生物病研究所, 助教授 (60226967) ; COSTANTINI Franklin d. Department of Genetics and Development, Columbia University ; CONSTANTINI エフ.ディー. コロンビア大学, 医学部, 教授 ; ROBERTSON E. ハーバード大学, 教授 ; F D Constant コロンビア大学, 医学部, 教授 ; E J Robertso ハーバード大学, 教授 ; MAX E Gottes コロンビア大学癌研究所, 所長
• 研究期間 (年度): 1992 – 1994
• 研究課題ステータス: 完了 (1994年度)
• 配分額: 14,700千円 (直接経費: 14,700千円); 1994年度: 4,900千円 (直接経費: 4,900千円); 1993年度: 4,900千円 (直接経費: 4,900千円); 1992年度: 4,900千円 (直接経費: 4,900千円)
• キーワード: ES細胞 / トランスサイレチン / 置換ベクター / ビタミンA / レチノール / レチノール結合タンパク質 / 甲状腺ホルモン / アミロイド / 血清アミロイドP成分

研究概要

1.先に、遺伝子標的組み込みを利用して作出したトランスサイレチン(ttr)遺伝子の双方にアレルに挿入変異をもち、TTRを完全に欠損した無TTRマウスを用いてTTR欠損が甲状腺ホルモンとビタミンAの代謝におよぼす影響について解析した。その結果、血中のレチノール、レチノール結合タンパク質、及び甲状腺ホルモナ(T_4)のレベルが、変異マウスにおいて有意に低下している事が明らかになった。
2.家族性アミロイドボリニューロパチー(FAP)ホモ接合体症例に近似した疾患モデルマウスの作出を目指し、且つFAPの病因となるヒト異型TTRのT_4やレチノールとの結合能力を検討する目的で、上記の無TTRマウスとヒト変異ttr遺伝子を運ぶFAPのトランスジェニックマウスモデルとを交配させ、マウス正常TTRを完全に欠損し、ヒト異型TTRのみを産生するマウス株を確立した。
3.上記2.のマウスでは、月齢11ヶ月頃から消化管を中心にアミロイドが沈着し始め、月齢を増すにつれ、沈着臓器の拡大傾向が見出された。なお、これらマウスと正常TTRとヒト異型TTRとを産生する同月齢の対照マウスとには、アミロイドの沈着程度や沈着臓器に差異を認めなかった。また、これらマウスには月齢20ヶ月でも末梢神経にアミロイドが沈着せず、神経障害を認めていない。
さらに、無TTRをマウスでは、血中のレチノール結合タンパク質及びT_4のレベルが、それぞれ、正常マウスの3%及び40%に低下しているが、これらヒト異型TTRのみを産生するマウス血中においては、レチノール結合タンパク質が正常値の84%に、T_4が56%に増加していることを見出した。
4.遺伝子型、表現型ともにFAPにより近似した優れた疾患モデルマウスの作出を目的に、遺伝子標的組み込みを利用して、マウスttr遺伝子の一方のアレルにヒトFAPの原因となる1塩基置換のみを導入する方法の確立を目指した。このため、先にttr遺伝子への挿入変異の導入に用いたと同じttr遺伝子領域から成る次のような点変異導入の為の置換ベクターを用いた。
置換ベクター[ttr遺伝子の第2エクソンにFAPの病因となる点変異を導入し、第2イントロンに選択マーカー(G418耐性遺伝子及び単純ヘルペスウイルスのtk遺伝子)を挿入した。そして、選択マーカー上流に隣接した約3kbの領域をマーカー下流に順向きに配置した]
この置換ベクターを、マウス胚性幹(ES)細胞にエレクトロポレーション法で導入し、G418に耐性となった細胞の中から、標的組み込みで変異が導入されたものをアレル特異的DNAポリメラーゼ増幅法(ASO-PCR法)で選択した。次に、上記の実験で選択した細胞株のもつ変異ttr遺伝子のイントロン内には、選択用のマーカー遺伝子が挿入されている。そこで、このマーカー遺伝子を欠失させ、点変異部のみが正常遺伝子と異なる変異遺伝子とする為、マーカーの両端に作製したイントロンによる順向きの繰り返し配列間の組換えによってマーカー遺伝子を欠失し、FIAU耐性となった細胞を選択した。
点変異導入用のベクターを取り込んだ約300個のG418耐性株をASO-PCR法で調べ、標的組換えで点変異が導入された2個のクローンを見出した。その一つを3.7×10_4cells/6cmdishとなるようにプレートし、FIAUで選択した。16個のFIAU耐性株を調べ、マーカー両端の繰り返し配列間の組換えでマーカーを欠失し、目的の点変異のみが導入された2個のクローンを見出した。そして、この変異ES細胞クローンをC57BL/6のブラストシストに注入し、キメラマウスを得ている。
以上の結果から、本法は簡便で効率の良い新しい点変異導入法として一般に応用可能と考えられる。

研究成果

• [文献書誌] T.Murakami: "A novel transthyretin mutation associated with familial amyloidotic polyneuropathy" Biochem.Biophys.Res.Comm.82. 520-526 (1992)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] T.Murakami: "Effect of serum amyloid P component level on transthyretin-derived amyloid deposition in a transgenic mouse model of familial amyloidotic polyneuropathy" Am.J.Pathol.142. 451-456 (1992)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] H.Qiu: "Chromosomal localization of the mouse prealbumin gene(ttr) by in situ hybridization" Cytogenet.Cell.Genet.61. 186-188 (1992)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] V.Episkopou: "Disruption of the transthyretin gene results in mice with depressed levels of plasma retinol and thyroid hormone" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 90. 2375-2379 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] K.Yamamura: "Transgenic mouse model for human genetic diseases" Molec.Reproduc.Develop.36. 248-250 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] K.Horie: "Structures of replacement vectors for efficient gene targeting" J.Biochem.(Tokyo). 115. 477-485 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] M.Nomura: "Isolation and characterization of retinoic acid-inducible cDNA clones in F9 cells:one of the early inducible clones encodes a novel protein sharing several highly homologous regions with a drosophila polyhomeotic protein" Differentiation. 57. 39-50 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] K.Horie: "Gene targeting by a vector with hairpin-shaped oligonucleotide caps" Biochem.Mol.Biol.Int.32. 1041-1048 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] S.Nishiguchi: "A survey of genes expressed in undifferentiated mouse embryonal carcinoma F9 cells:characterization of low-abundance mRNAs" J.Biochem.(Tokyo). 116. 128-139 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] M.Nomura: "One of the retinoic acid-inducible cDNA clones in mouse embryonal carcinoma F9 cells encodes a novel isoenzyme of fructosel,6-bisphosphatase" FEBS Lett.348. 201-205 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Joana A.Palha: "Thyroid hormone metabolism in a transthyretin-null mouse strain" J.Biol.Chem.269. 33135-33139 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] S.Wei: "Studies on the metabolism of retinol and retinol-binding protein in transthyretin-deficient mice produced by homologous recombination" J.Biol.Chem.270. 866-870 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Y.Nagata: "A 6-kb upstream region of the human transthyretin gene can direct developmental,tissue-specific,and quantitatively normal expression in transgenic mouse" J.Biochem.(Tokyo). 117. 169-175 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] 堀江恭二、島田和典: "遺伝学領域におけるトランスジェニックマウス" 臨床科学. 28. 895-902 (1992)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] 島田和典: "家族性アミロイドポリニューロパチー" 臨床検査. 36. 221-222 (1992)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] 島田和典、西口聖治: "家族性アミロイドポリニューロパチー" 臨床医、「検査値のみかた」. 19(臨時増刊号). 467-471 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] 島田和典、前田秀一郎: "マウス胚性幹細胞を利用したヒト疾患モデル動物の作製" 学術月報. 46. 833-837 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] K.Yamamura,F.Tashiro,S.Wakasugi,S.Yi,S.Maeda,K.Shimada: "Analysis of the pathological process of dominant disease:familial amyloidotic polyneuropathy In "Molecular Approaches to the Study and Treatment of Human Diseases",eds.T.O.Yoshida & J.M.Wilson." Elsevier Science Publishers B.V., 8 (1992)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] 西口聖治、野村みどり、瀧原義宏、島田和典: "新生化学実験講座、2 クローニングベクター" 東京化学同人社, 26 (1992)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] 島田和典、西口聖治: "臨床遺伝医学III-分子病 古庄敏行他編 家族性アミロイドポリニューロパチー" 診断と治療社(東京), 6 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] 前田秀一郎、島田和典: "「遺伝子病入門」、高久史麿他編 遺伝子病の解析-遺伝子病のDNA解析" 南江堂(東京), 17 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] 島田和典、西口聖治: "「分子病理学-疾病の分子機構」、杉山武敏編 家族性アミロイドポリニューロパチー" 文光堂(東京), 5 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] 島田和典、前田秀一郎、滝原義宏著: "「遺伝病」(島田和典編)" 化学同人社(京都), (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] 島田和典、前田秀一郎共著: "「遺伝子診断-その原理と応用」" 南江堂(東京), 110 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] T.Murakami, S.Maeda, S.Yi, S.Ikegawa, E.Kawashima, S.Onodera, K.Shimada, S.Araki: "A novel transthyretin mutation associated with familial amyloidotic polyneuropathy" Biochem.Biophys.Res.Comm.82. 520-526 (1992)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] T.Murakami, S.Yi, S.Maeda, F.Tashiro, K.Yamamura, K.Takahashi, K.Shimada, S.Araki: "Effect of serum amyloid P component level on transthyretin-derived amyloid deposition in a transgenic mousemodel of familial amyloidotic polyneuropathy" Am.J.Pathol.142. 451-456 (1992)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] H.Qiu, K.Shimada, Z.Cheng: "Chromosomal localization of the mouse prealbumin gene(ttr)by in situ hybridization" Cytogenet.Cell.Genet.61. 186-188 (1992)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] V.Episkopou, S.Maeda, S.Nishiguchi, K.Shimada, G.A.Gaitanaris, M.E.Gottesman, E.J.Robertson: "Disruption of the transthyretin gene results in mice with depressed levels of plasma retinol and thyroid hormone" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 90. 2375-2379 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] K.Yamamura, F.Tashiro, S.Yi, S.Wakasugi, S.Araki, S.Maeda, K.Shimada: "Transgenic mouse model for human genetic diseases" Molec.Reproduc.Develop.36. 248-250 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] K.Horie, S.Nishiguchi, S.Maeda, K.Shimada: "Structures of replacement vectors for efficient gene targeting" J.Biochem.(Tokyo). 115. 477-485 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] M.Nomura, Y.Takihara, K.Shimada: "Isolation and characterization of retinoic acid-inducible cDNA clones in F9 cells one of the early inducible clones encodes a novel protein sharing several highly homologous regions with a drosophila polyhomeotic protein" Differentiation. 57. 39-50 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] K.Horie, K.Shimada: "Gene targeting by a vector with hairpin-shaped oligonucleotide caps" Biochem.Molecular Biol.Int. 32. 1041-1048 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] S.Nishiguchi, T.Joh, K.Horie, Z.Zou, T.Yasunaga, K.Shimada: "A survey of genes expressed in undifferentiated mouse embryonal carcinoma F9 cells : characterization of low-abundance mRNAs" J.Biochem.(Tokyo). 116. 128-139 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] M.Nomura, Y.Takihara, T.Yasunaga, K.Shimada: "One of the retinoic acid-inducible cDNA clones in mouse embryonal carcinoma F9 cellsencodes a novel isoenzyme of fructosel, 6-bisphosphatase" FEBS Let.348. 201-205 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] J.A.Palha, V.Episkopou, S.Maeda, K,Shimada, M.E.Gottesman, M.J.M.Saraiva: "Thyroid hormone metabolism in a transthyretin-null mouse strain" J.Biol.Chem.269. 33135-33139 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] S.Wei, V.Episkopou, R.Piantedosi, S.Maeda, K.Shimada, M.E.Gottesman, W.S.Blaner: "Studies on the metabolism of retinol and retinol-binding protein in transthyretin-deficient mice produced by homologous recombination" J.Biol.Chem.270. 866-870 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Y.Nagata, F.Tashiro, S.Yi, T.Murakami, S.Maeda, K.Takahashi, K.Shimada, H.Okamura, K.Yamamura: "A 6-kb upstream region of the human transthyretin gene can direct developmental, tissue-specific, and quantitatively normal expression in transgenic mouse" J.Biochem.(Tokyo). 117. 169-175 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] K.Yamamura, F.Tashiro, S.Wakasugi, S.Yi, S.Maeda, K.Shimada: Elsevier Science Publishers B.V.Analysis of the pathological process of dominant disease : familial amyloidotic polyneuropathy, 377-384 (1992)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] V.Episkopou: "Disruption of the transthyretin gene results in mice with depressed levels of plasma retinol and thyroid hormone" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 90. 2375-2379 (1993)
• [文献書誌] K.Horie: "Structure of replacement vectors for efficient gene targeting" J.Biochem.(Tokyo). in press (1994)
• [文献書誌] M.Nomura: "Isolation and characterization of retinoic acid inducible cDNA clones in F9 cells:One of the early inducible clones encodes a novel protein sharing several highly homologous regions with a Drosophila polyhomeotic protein" Differentiation. in press (1994)
• [文献書誌] S.Nishiguchi: "A survey of genes expressed in undifferentiated mouse embryonal carcinoma F9 cells:Characterization of low-abundance mRNAs" J.Biochem.(Tokyo). (Submitted)
• [文献書誌] S.Wei: "Studies on the metabolism of retinol and retinolbinding protein in transthyretin-deficient mice produced by homologous recombination" J.Biol.Chem.(Submitted)
• [文献書誌] 島田和典、前田秀一郎: "マウス胚性幹細胞を利用したヒト疾患モデル動物の作製" 学術月報. 46. 833-837 (1993)