| 研究概要 |
イノシトール1,4,5-三リン酸(IP_3)は細胞内小胞体の含有するCa^<2+>を放出させることにより,細胞内情報伝達系の重要な一翼を担っている。血管平滑筋においても薬物-収縮関連機構の細胞メッセンジャーとして生理的役割を果たしていると考えられている。血管平滑筋からIP_3認識蛋白を精製するため,IP_3親和性カラムを作製した。はじめにIP_3認識蛋白が大量に存在するラット大脳を用いた。ラット大脳可溶性画分をIP_3親和性カラムにかけ,0.5Mおよび2MNaCl溶液で吸着蛋白を順次溶出した。それぞれの分勘について〔 ^3H〕IP_3結果を調べたところ2Mでの溶出画分に高い結合活性が存在した。2M溶出画分をさらに分画するためゲルロ過カラムにかけた。標準試料200kDと66kDの間で二相性の〔 ^3H〕IP_3結合活性を認められた。SDS電気詠動で分析したところ,それぞれ130kDと85kDの分子に基ずくことが分った。これらのIP_3結合分子精製の成功はIP_3親和性カラムの使用によるところが大きい。引き続くゲルロ過クロマトグラフィーはIP_3結合分子を二つに分けると共に更なる精製をもたらした。130kDと85kDの精製サンプルにリジルエンドペプチターゼを作用させ逆相HPLCで生成ペプチドを分離した。それぞれ三種のペプチドについて部分アミノ酸配列を決定した。Swiss-Protデータベースを用いてホモロジー検索を行ったところ,85kD分子からのペプチドはPLCのδ型アイソザイムのものと一致した。これに対して,130kDからのものには,既知のものとの類似性は認められず,全く新しいものであることが分かった。ラット大動脈平滑筋を用いてIP_5結合分子の精製を試みたところ,同様の2種類の分子の存在が認められた。
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