| 研究課題/領域番号 |
04266211
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| 研究種目 |
重点領域研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
高野 幹久 京都大学, 医学部, 講師 (20211336)
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| 研究分担者 |
平井 みどり 京都大学, 医学部, 助手 (70228766)
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| 研究期間 (年度) |
1992
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| 研究課題ステータス |
完了 (1992年度)
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| 配分額 *注記 |
1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
1992年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
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| キーワード | 腎尿細管 / 有機カチオン輸送系 / 刷子縁膜 / 側底膜 / 膜小胞 / アフリカツメガエル卵母細胞 / 発現クローニング |
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| 研究概要 |
腎臓の近位尿細管上皮細胞には有機カチオン輸送系が存在し、カチオン性の薬物等を能動的に尿中へと排泄する。これまでに刷子縁膜(管腔側)、側底膜(血管側)小胞を用い、前者ではH^+/有機カチオン対向輸送系が、後者では膜電位依存性の輸送体が関与することが明らかにされている。本研究では、有機カチオン輸送に関与するアミノ酸残基を同利定し、機能との関連性から考察を加えた。さらに輸送体の構造を明らかにすることを目的として、アフリカツメガエル卵母細胞を用いた発現クローニング法により遺伝子のクローニングを試みた。
1.ラット腎皮質より刷子縁膜及び側底膜小胞を単離精製し、これら膜小胞を種々のアミノ酸残基修飾試薬で処理した後、迅速ろ過法により有機カチオン(テトラエチルアンモニウム;TEA)輸送活性を測定した。カルボキシル基、アルギニン残基、SH基はすずれも両細胞幹におけるTEA輸送に関与していた。しかし、SH基の役割は両細胞膜で異なっており、刷子縁膜では基質の結合に関与するものと推察された。ヒスチジン残基は、刷子縁膜におけるTEA輸送にのみ関与しており、H^+との共役過程に重要な役割を果たしているものと推察された。
2.アフリカツメガエル卵母細胞に腎皮質mRNAを注入したところ、TEA輸送活性の発現が認められた。卵母細胞におけるTEA輸送は、有機カチオカ輸送阻害剤である塩化水銀やシメチジンにより阻害された。さらに蔗糖密度勾配遠心によりmRANをサイズ分画した後、各フラクションによるTEA輸送活性発現を検討し、活性発現に関与するmRNAサイズが1.4-2.4kbであることを明らかにした。現在このフラクションからcDNA、cRNAを合成し、単一のクローン得るべく、スクリーニングを続けている。
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