| 研究課題/領域番号 |
04454097
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| 研究種目 |
一般研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
水産化学
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
清水 潮 広島大学, 生物生産学部, 教授 (30101083)
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| 研究分担者 |
山本 民次 広島大学, 生物生産学部, 講師 (40240105)
松田 治 広島大学, 生物生産学部, 教授 (60034469)
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| 研究期間 (年度) |
1992 – 1993
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| 研究課題ステータス |
完了 (1993年度)
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| 配分額 *注記 |
4,800千円 (直接経費: 4,800千円)
1993年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
1992年度: 3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
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| キーワード | ビブリオ科 / 16SrRNA / リボソームRNA / 塩基配列 / 細菌の検出 / 海洋細菌 / ビブリオ・ハーベイ / DNAプローブ / ハイブリダイゼーション / 化学発光 |
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| 研究概要 |
本研究では海洋細菌、とくにビブリオ科細菌の16SrRNAが、種あるいは属に特異的な配列を有していることを利用し、非放射性標識物質であるビオチンを結合した16SrRNA-標的プローブを使用し、メンブレン上の海洋細菌の16SrRNAとのハイブリダイゼーションによる検出を目的として、方法の検討を行った。
使用した菌はVibrio harveyiを中心とするビブリオ科細菌で、対照としてEscherichia coliおよびAlteromonashaloplanktisなどの菌、合計8種の細菌を用いた。使用したプローブは、全部の菌に相補性を持つユニバーサルプローブとV.harveyiだけに特異的に相補性を持つプローブであった。実験では、ハイブリダイゼーション法について、適切なメンブレンの選択、使用するバファーの組成についての検討、ハイブリダイゼーションと洗浄時の温度、時間、プローブの量などの条件の検討、また、検出時条件の検討などを行った。
実験の結果、検出を発光法で行なった場合、10^4程度の数の細菌が存在すれば検出が可能になった。しかし、V.harveyiだけに完全な相補性をもつ筈のプローブを使用したとき、V.harveyiとそれ以外の9種類の菌に発光シグナルが現れ、検討の結果、使用した海洋細菌細菌、とくにA.haloplanktisの菌体には発光試薬に反応して発光を起させる物質のあることが分った。検出法をBCIP/NBT試薬を用いて、発色法によって行った。この場合V.harveyiとE.coliとの区別はできたが、V.harveyiと他の海洋細菌とくにA.haloplanktisとの十分な種特異性をもつような方法の確立には至らなかった。
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