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アミノ基転移酵素の基質認識と活性発現機構の理解をめざして

研究課題

研究課題/領域番号 04454160
研究種目

一般研究(B)

配分区分補助金
研究分野 医化学一般
研究機関大阪医科大学

研究代表者

鏡山 博行  大阪医科大学, 医学部, 教授 (80028555)

研究期間 (年度) 1992 – 1994
研究課題ステータス 完了 (1994年度)
配分額 *注記
7,300千円 (直接経費: 7,300千円)
1994年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
1993年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
1992年度: 4,800千円 (直接経費: 4,800千円)
キーワードアミノ基転移酵素 / アスパラギン酸アミノ基転移酵素 / 酵素反応機構 / 構造と機能相関 / 酵素の活性中心 / 蛋白質工学 / ピリドキサル酵素 / トランスアミナーゼ / タンパク質工学 / 酵素活性中心 / 酵素の構造と機能 / 部位特異的突然変異 / B_6酵素
研究概要

X線結晶解析が完成したアスパラギン酸アミノ基転移酵素(AspAT)の蛋白質工学を中心に,芳香族アミノ酸(AroAT),分岐鎖アミノ酸(BrAT)の各アミノ基転移酵素についての研究を加えて,基質特異性や効率的な反応進行に働いている分子設計をさぐってきた。得られた成果を以下に記す。
AspAT:1.Asp222,補酵素ピリドキサール燐酸(PLP)をつなぎ留め,同時にそのピリジン環Nの正荷電を安定化してPLPの「電子溜め」効果を強めている。2.Asn194,基質のα-COOH基を結合するArg386を適正な位置に固定するとともに,Arg386からPLPの3′-(0)へと続く水素結合網を形成することによって電子分布を調節し,トランスアルジミネーションを効率よく行わす役を演じている。3.Arg292とArg386,Arg292は基質ジカルボン酸のω-COOH基を認識している。この2残基に基質が結合すると,活性中心を外界から遮閉するように酵素分子のコンホメーションが変化し,さらにArgの正電荷が中和されることによって,近傍の触媒基であるLys258の塩基性が高まり,後続の反応(トランスアルジミネーション)の進行に都合の良い環境ができる。
AroAT:大腸菌体内で酵素の大量生産系を確立。精製酵素の性質を調べた。AspATと基質特異性が重複,酸性アミノ酸に対しては〓度,芳香族アミノ酸に対しては三桁高い活性を示す。芳香環の認識部位はArg292の近傍で,より疎水性で〓。Arg386とAsn194はAspATにおけるのと同じ役割を果たしている。
BrAT:X線結晶解析が重原子置換を行える段階にきた。基質のα-プロトンの引き抜きの過程での立体特異性がD-アミノ酸アミノ基転移酵素と同じであり,その他のアミノ基転移酵素とは異るグループに分類されるという,興味深い結果が得られた。

報告書

(4件)
  • 1994 実績報告書   研究成果報告書概要
  • 1993 実績報告書
  • 1992 実績報告書
  • 研究成果

    (39件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (39件)

  • [文献書誌] Yano,T.: "Role of Asp222 in the catalytic mechanism of Escherichia coli aspartate aminotransferase:The amino acid residue which enhances the function of the enzyme-bound coenzyme pyridoxal 5′-phosphate." Biochemistry.31. 5878-5887 (1992)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Tanaka,T.: "Further studies on aspartate aminotransferase of thermophilic methanogens by analysis of general properties,bound cofactors,and subunit structures" J.Biochem.112. 811-815 (1992)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
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      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Yano,T.: "A hydrogen-bonding network modulating enzyme function:Asparagine194 and Tyrosine225 of Escherichia coli aspartate aminotransferase" Biochemistry.32. 1810-1815 (1993)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
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      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Yoshimura,T.: "Unique stereospecificity of D-amino acid aminotransferase and branched-chain L-amino acid aminotransferase for C-4′hydrogen transfer of the coenzyme" J.Am.Chem.Soc.115. 3897-3900 (1993)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hayashi,H.: "Escherichia coli aromatic amino acid amiotransferase:Characterization and comparison with aspartate aminotransferase" Biochemistry.32. 1229-1239 (1993)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Yano,T.: "Role of an active site residue analyzed by combination of mutagenesis and coenzyme analog." J.Mol.Biol.234. 1218-1229 (1993)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
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      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Matsushima,Y.: "Replacement of active site lysine-239 of thermostable aspartate aminotransferase by S-(2-aminoethyl)cysteins:Properties of the mutant enzyme" J.Biochem.115. 108-112 (1994)

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      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Iwasaki,M.: "Protonatin state of the active-site Schiff base of aromatic amino acid aminotransferase:Modulation by binding of ligands and implications for its role in catalysis" J.Biochem.115. 156-161 (1994)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
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      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Tanaka,T.: "Aspartate aminotransferase from thermophilic formate-utilizing methanogen:Relation to serine and phosphoserine aminotransferase,but not to the aspartate aminotransferase family" J.Biochem.115. 309-317 (1994)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
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      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Okamoto,A.: "X-ray crystallogrophic study of pyridoxal 5'-phosphate type aspartate aminotransferase from E.coli in open and closed conformation" J.Biochem.116. 95-107 (1994)

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      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Miyahara,I.: "X-ray crystallographic study of pyridoxamine 5'-phosphate type aspartate aminotransferase from E.coli in three froms" J.Biochem.116. 1001-1012 (1994)

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      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Metzler,D.E.: "NMR studies of ^1H resonances in the 10-18 ppm range for aspartate aminotransferase from E.coli" J.Biol.Chem.269. 28027-28033 (1994)

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      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kagamiyama,H.: "Enzyme-substrate interactions modulating protonation and tautomerization states of the aldimines of pyridoxal enzymes" BioChemistry of Vitamin B6 and PQQ.43-47 (1994)

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      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Yano, T.: "Role of Asp222 in the catalytic mechanism of Escherichia coli aspartate aminotransferase : The amino acid residue which enhances the function of the enzyme-bound coenzyme pyridoxal5'-phosphate." Biochemistry. 31. 5878-5887 (1992)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
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      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Tanaka, T.: "Further studies on aspartate aminotransferase of thermophilic methanogens by analysis of general properties, bound cofactors, and subunit structures" J.Biochem.112. 811-815 (1992)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
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      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Yano, T.: "A hydrogen - bonding network modulating enzyme function : Asparagine194 and Tyrosine225 of Escherichia coli aspartate aminotransferase" Biochemistry. 32. 1810-1815 (1993)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
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      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Yoshimura, T.: "Unique stereospecificity of D-amino acid aminotransferase and branchedchain L-amino acid aminotransferase for C-4' hydrogen transfer of the coenzyme" J.Am.Chem.Soc.115. 3897-3900 (1993)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hayashi, H.: "Escherichia coli aromatic amino acid amiotransferase : Characterization and comparison with aspartate aminotransferase" Biochemistry. 32. 1229-1239 (1993)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Yano, T.: "Role of an active site residue analyzed by combination of mutagenesis and coenzyme analog." J.Mol.Biol.234. 1218-1229 (1993)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Matsushima, Y.: "Replacement of active site lysine - 239 of thermostable aspartate aminotransferase by S- (2-aminoethyl) cysteins : Properties of the mutant enzyme" J.Biochem.115. 108-112 (1994)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Iwasaki, M.: "Protonatin state of the active-site Schiff base of aromatic amino acid aminotransferase : Modulation by binding of ligands and implications for its role in catalysis" J.Biochem.115. 156-161 (1994)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Tanaka, T.: "Aspartate aminotransferase from thermophilic formate - utilizing methanogen : Relation to serine and phosphoserine aminotransferase, but not to the aspartate aminotransferase family" J.Biochem. 115. 309-317 (1994)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Okamoto, A.: "X - ray crystallogrophic study of pyridoxal5' -phosphate type aspartate aminotransferase from E.coli in open and closed conformation" J.Biochem.116. 95-107 (1994)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Miyahara, I.: "X-ray crystallographic study of pyridoxamine 5' - phosphate type aspartate aminotransferase from E.coli in three forms" J.Biochem.116. 1001-1012 (1994)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Metzler, D.E.: "NMR studies of ^1H resonances in the 10-18 ppm range for aspartate aminotransferase from E.coli" J.Biol.Chem.269. 28027-28033 (1994)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kagamiyama, H.: "Enzyme-substrate interactions modulating protonation and tautomerization states of the aldimines of pyridoxal enzymes" Biochemistry of Vitamin B6 and PQQ. 43-47 (1994)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1994 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Tanaka,T.: "Aspartate aminotransferase from a thermophilic formate-utilizing methanogen,methanobacterium thermoformicicum strain SF-4" J,Bio.Chem.115. 309-317 (1994)

    • 関連する報告書
      1994 実績報告書
  • [文献書誌] Okamoto,A.: "X-ray crystallographic study of pyridoxal 5-phosphate-type aspartate aminotransferase from Escherichia coli in open and closed conformation" J,Bio Chem.116. 95-107 (1994)

    • 関連する報告書
      1994 実績報告書
  • [文献書誌] Miyahara,I.: "X-ray cycstallographic study of pyridoxamine 5-phosphate-type aspartate aminotransferase from Escherichia coli in three forms." J,BioChem.116. 1001-1012 (1944)

    • 関連する報告書
      1994 実績報告書
  • [文献書誌] Metzler,D.E.: "NMR studies of ^1H resonances in the 10-18 ppm range for aspartate aminotransferase from Escherichia coli" J,Biol.Chem.269. 28027-28033 (1994)

    • 関連する報告書
      1994 実績報告書
  • [文献書誌] Hideyuki Hayashi: "Escherichia coli Aromatic Amino Acid Aminotransferase:Characterization and Comparison with Aspartate Aminotransferase" Biochemistry. 32. 12229-12239 (1993)

    • 関連する報告書
      1993 実績報告書
  • [文献書誌] Takato Yano: "A Hydrogen-Bonding Network Modulating Enzyme Function:Asparagine 194 and Tyrosine 225 of E.coli Aspartate Aminotransferase" Biochemistry. 32. 1810-1815 (1993)

    • 関連する報告書
      1993 実績報告書
  • [文献書誌] Takato Yano: "Role of an Active Site Residue Analyzed By Combination of Mutagenesis and Coenzyme Analog" J.Mol.Biol.234. 1218-1229 (1993)

    • 関連する報告書
      1993 実績報告書
  • [文献書誌] Masahiro Iwasaki: "Protonation State of the Active Site Schiff Base of Aromatic Amino Acid Aminotransferase:Modulation by Binding of Ligands and Implications for Its Role in Catalysis" J.Biochem.115. 156-161 (1994)

    • 関連する報告書
      1993 実績報告書
  • [文献書誌] Yutaka Matsushima: "Replacement of Active-Site Lysine-239 of Thermostable Aspartate Amino-transferase by S-(2-Aminoethy)Cysteine:Properties of the Mutant Enzyme" J.Biochem.115. 108-112 (1994)

    • 関連する報告書
      1993 実績報告書
  • [文献書誌] Tanaka,T.: "Further studies on aspartate aminotransferase of thermophilic methanogens by analsis of general properties,bound cofactors,and subunit structures." J.Biochem.112. 811-815 (1992)

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      1992 実績報告書
  • [文献書誌] Kawasaki,Y.: "Evaluation of the holoenzyme content of aromatic L-amino acid decarboxylase in brain and liver tissue" Biochem.Biophys.Res.Commun.186. 1242-1248 (1992)

    • 関連する報告書
      1992 実績報告書
  • [文献書誌] Yano,T.: "Role of Asp222 in the catalytic mechanism of Escherichia coli aspartate aminotransferase:The amino acid residue which enhances the function of the enzymebound coenzyme pyridoxal 5'-phospkate" Biochemistry. 31. 5878-5887 (1992)

    • 関連する報告書
      1992 実績報告書
  • [文献書誌] Hayashi,H.: "Rat liver L-amino acid decarboxylase:Spectroscopic and kinetic analysis of the coenzyme and reaction intermediates" Biochemistry. 32. 812-818 (1993)

    • 関連する報告書
      1992 実績報告書

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公開日: 1992-04-01   更新日: 2016-04-21  

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