| 研究課題/領域番号 |
04454598
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| 研究種目 |
一般研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
物質生物化学
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| 研究機関 | 理化学研究所 |
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研究代表者 |
花岡 文雄 理化学研究所, 細胞生理学研究室, 主任研究員 (50012670)
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| 研究分担者 |
益谷 央豪 理化学研究所, 細胞生理学研究室, 基礎特研 (40241252)
菅澤 薫 理化学研究所, 細胞生理学研究室, 研究員 (70202124)
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| 研究期間 (年度) |
1992 – 1993
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| 研究課題ステータス |
完了 (1993年度)
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| 配分額 *注記 |
6,400千円 (直接経費: 6,400千円)
1993年度: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
1992年度: 4,000千円 (直接経費: 4,000千円)
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| キーワード | DNAポリメラーゼα / 温度感受性変異株 / 増殖復帰株 / プライマーゼ / 発現制御 / 過剰発現 / DNAポリメラーゼalpha / 細胞周期 / 温度感受性突然変異株 / PCR-SSCP法 / 遺伝子発現 |
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| 研究概要 |
マウスFM3A細胞から分離した、DNAポリメラーゼαの温度感受性変異株、tsFT20、の180KサブユニットのcDNAを分離し、全塩基配列を決定した。その結果、1180番目のアミノ酸がセリンからフェニルアラニンに変化するような点突然変異を見出した。この変異株に、野生型180KサブユニットのcDNAを導入し、発現させたところ、温度感受性が相補された。従って、この変異がts性を引き起こしていると結論した。更に複数の増殖復帰株についても解析したところ、そのいずれもが、tsFT20細胞の突然変異点はそのままで、その近傍に第2の変異点を持っていた。
我々が既にクローニングし、全塩基配列を決定しているマウスDNAポリメラーゼα/プライマーゼを構成する4つのサブユニットのcDNAをプローブとして、4つのサブユニット遺伝子の細胞周期における発現様式をノーザンブロット法により調べた、その結果、GO期では、この4つの遺伝子はほとんど発現しておらず、血清刺激によるDNA合成に先立って、協調的に発現が誘導された。次に、これら4遺伝子の発現調節の機構を調べるために、それぞれの遺伝子上流域をクローニングし、塩基配列を決定した。4遺伝子とも転写開始点から300bp以内の領域に、1〜2個のE2F結合配列および10〜14bpからなるパリンドローム配列と1個のAP1配列が存在した。
一方、蛋白質レベルでの解析を行うため、各cDNAを大腸菌あるいは昆虫細胞で過剰発現させ、精製した各サブユニットを抗原として、ポリクローナル抗体を作成した。共沈降反応等により、各サブユニット間の相互作用を調べたところ、54Kサブユニットが他のサブユニットすべてに親和性を持つことを見い出した。更に発現・単離した180KサブユニットにはDNAポリメラーゼα活性が、46Kサブユニットにはプライマーゼ活性が、それぞれ検出された。
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