| 研究課題/領域番号 |
04557024
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| 研究種目 |
試験研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
細菌学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
西渕 光昭 京都大学, 医学部, 助教授 (50189304)
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| 研究分担者 |
福島 繁 島津製作所, 技術研究本部中央研究所, 主任研究員
倉園 久生 京都大学, 医学部, 助手 (90186487)
竹田 美文 京都大学, 医学部, 教授 (30029772)
高野 純 島津製作所, 技術研究本部中央研究所, 主任研究員
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| 研究期間 (年度) |
1992 – 1993
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| 研究課題ステータス |
完了 (1993年度)
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| 配分額 *注記 |
12,900千円 (直接経費: 12,900千円)
1993年度: 3,300千円 (直接経費: 3,300千円)
1992年度: 9,600千円 (直接経費: 9,600千円)
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| キーワード | 食中毒原因細菌 / 腸炎ビブリオ / 毒素原性大腸菌 / Veto毒素 / コレラ毒素 / PCR法 / DNA増幅法 / Vero毒素 / 病原大腸菌 / 黄色ブドウ球菌 / エンテロトキシン遺伝子 |
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| 研究概要 |
本研究では、食中毒の確認のため、サンプル中の原因細菌の特定の遺伝子(主として病原因子遺伝子)に着目し、これをDNA増幅法(PCR法)によって短時間で、しかも自動化した装置によるサンプル処理法およびDNA検出法と組み合わせることによって簡便に検出するシステムを開発することを目的とした。このアプローチで最も重要な点は、得られる結果(検出の特果性および感度)を決定する要因である増幅用オリゴヌクレオイドプライマーの選定及び増幅条件の確立である。この点に関して、実際に多くの分離菌株を用いた試験を繰り返すという実験的方法に基づいた方法によって、重要な食中毒原因細菌のそれぞれを検出するためのPCR法を確立した。この方法により、腸炎ビブリオの耐熱性溶血毒遺伝子(tdh)およびtdh類似遺伝子(trh)、大腸菌の易熱性エンテロトキシ遺伝子、耐熱性エンテロトキシ遺伝子、およびVero毒素遺伝子、黄色ブドウ球菌の各種エンテロトキシ遺伝子および毒素性ショック症候群毒素遺伝子、ならびにコレラ菌のコレラ毒素遺伝子を検出するためのプライマーセットおよび増幅条件を確立した。
一方で、このようにして確立したPCR法を自動化装置に適用できるような増幅断片の検出システムを開発した。すなわち、PCR産物をビオチンで標識して、アフィニティ法によりマイクロタイタートレーの穴にトラップした。これを非アイソトープ(アルカリフォスファターゼ)標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出した。数コピーの標的遺伝子を所要時間45分で検出でき、今までに報告された方法の中で最も速いことがこの方法の最大の特徴である。
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