| 研究課題/領域番号 |
04558025
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| 研究種目 |
試験研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
物質生物化学
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
川畑 俊一郎 九州大学, 理学部, 助手 (90183037)
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| 研究分担者 |
西野 憲和 九州工業大学, 工学部, 教授 (40145165)
岩永 貞昭 九州大学, 理学部, 教授 (90029942)
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| 研究期間 (年度) |
1992 – 1993
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| 研究課題ステータス |
完了 (1993年度)
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| 配分額 *注記 |
5,400千円 (直接経費: 5,400千円)
1993年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
1992年度: 3,300千円 (直接経費: 3,300千円)
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| キーワード | ビタミンK依存性凝固因子 / プロペプチド / プロセシング酵素 / メタルエンドペプチダーゼ / 蛍光基質 / プロペプチド酵素 / プロセシング / メタルプロテアーゼ / 蛍光性ペプチド基質 / 合成阻害剤 |
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| 研究概要 |
我々は、ビタミンK依存性凝固因子のプロペプチドプロセシング酵素を得る目的で、プロセシング部位を基に合成したデカペプチドを基質としてをウサギ肝臓のミクロゾーム分画より、新規のメタロエンドペプチダ-セ(MEP)を精製した。その際、合成ペプチドのP1位とP4位のArgに対してMEPが高い基質特異性を持つことを示した。MEPの全cDNA配列を決定したところ、そのアミノ酸配列は、Ca依存性のプロセシング酵素であるKex2プロテアーゼファミリーとは異なり、ホルモンペプチドの代謝に関与しているmetalloendopeptidase24.15と非常に高い相同性(60%)を示した。今回、ペプチド20種に対するMEPの基質特異性を調べた。37℃,1h(E/S=1/300)の条件下、最もよく水解されたペプチドはα-neoendorphin(K-Yの間)とbradykinin(F-Sの間)であり、それぞれ反応前の75%,87%の切断が見られた。また、BAM-12PやSubstancePは、複数の部位で切断され、P1,P4部位の特異性は明確ではなかった。なお、MEPは、metalloendopeptidase24.15の基質であるdynorphin Aをまったく水解しなかった。次に、切断部位の配列を基に蛍光消光系ペプチド基質を合成し、HPLCで切断位置を確認し、Km,Kcatを算出した。Abz-ARVRRANS-Dna(水解位置,R-A)やAbz-ARVTRANS-Dnaは非常に良い基質となり、MEPの簡便で高感度な測定系が確立された。一方、bradykininを基に合成したAbz-ARPPGFSA-Dnaに対してはMEPは反応せず、bradykininの全体的な二次構造を認識していることが考えられた。一方で、ブタのアンジオテンシンII結合タンパク質のcDNAを解析していた東工大の広瀬らのグループは、そのアミノ酸配列がMEPと著しい(93%)相同性を示すことを見出した(最近の私信による)。現在、一連の研究で見い出されたペプチド基質のアミノ末端側あるいは、カルボキシル末端側にZnに対して配位子となりそうな原子団を結合した拮抗阻害剤の合成を進めている。
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