| 研究課題/領域番号 |
04660077
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
応用生物化学・栄養化学
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| 研究機関 | 埼玉大学 |
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研究代表者 |
松崎 博 埼玉大学, 理学部, 助手 (80008870)
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| 研究分担者 |
松本 幸次 埼玉大学, 理学部, 助教授 (00119140)
渋谷 勲 埼玉大学, 理学部, 教授 (60013306)
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| 研究期間 (年度) |
1992 – 1993
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| 研究課題ステータス |
完了 (1993年度)
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| 配分額 *注記 |
2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
1993年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
1992年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
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| キーワード | リン脂質 / 高度好熱細菌 / カルジオリピン / 酸性リン脂質 / 大腸菌 / 遺伝子クローニング / 高度好熱菌 |
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| 研究概要 |
生体膜構成成分として不可欠なリン脂質、特に酸性リン脂質カルジオリピン(CL)、その前駆体ホスファチジルグリセロール(PG)の機能発現および制御過程を解明のため、高度好熱菌CL合成系遺伝子をクローニングし、リン脂質を安定に大腸菌で大量に合成することを目的とした。[1]高度好熱菌(Thermus thermophilus)HB8株染色体DNA断片をクローニングベクタpNS582tet14Ad(Dupont)を用いてin vitroでP1 phage粒子にまたはプラスミドpWSK129のBamHI部位へパッケージングし、得られた染色体DNA断片を挿入したプラスミドにより、大腸菌ホスファチジルグリセロリン酸(PGP)シンターゼ遺伝子(pgsA)の欠損変異 pgsA3株、またCLシンターゼ遺伝子(cls)欠失変異(cls::kan)とホスファチジルセリンシンターゼ温度感受性変異(pssA1^<ts>)を同時に保持した株を形質転換し、変異を相補する株を選択した。この結果、ampicillin耐性でpgsA3変異に関わる低浸透圧NBY培地で生育する株が9株、また運動性が回復した株が5株分離された。すべての形質転換株においてはPGまたはCL合成の回復が認められなかった。[2]我々で構築した大腸菌における膜リン脂質の生合成、組成を改変するリン脂質合成酵素遺伝子の増幅あるいは欠損、欠失変異株が標題細菌遺伝子クローニングの際、変異相補の選択指標になりうるかどうかを調べ、有用な指標を上記クローニングに用いた。1)大腸菌のCL合成は生育定常期に増大し、CL合成酵素活性も約10倍に増加した。一方、CL合成酵素欠失変異(cls::kan)株では定常期以降で菌の生存率が1万分の1に低下した。CLが生育定常期に必須で、細胞周期依存的にCLが機能と推察した。2)酸性リン脂質合成開始過程のPGPシンターゼの点突然変異でその合成が大幅に低下したpgssA3変異株では野生株に比べ低浸透圧培地(NBY)で生育せず、菌の運動性が低下し、鞭毛蛋白質の合成が欠損し、鞭毛合成制御遺伝子flhDの転写発現低下と対応していた。これらの結果は大腸菌でも未知の酸性リン脂質合成の制御に関わる遺伝的要因を増幅という条件で好熱細菌で見いだした可能性もあり、好熱細菌を含めて他の生物でのカルジオリピン合成系遺伝子の本格的クローニングのためにきわめて有用な知見と言える。
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