| 研究概要 |
本研究は著者等の発見したペプスタチン非感受性カルボキシルプロテアーゼ(CP)のうち,Pseudomonas sp.No.101 CPに的を絞って,本酵素の構造と機能の解析,特に触媒残基の同定を目的とする。本酵素は,(1)原核生物由来の最初のCPであり,(2)その全一次構造は既報のCPを含め,いずれのタンパク質とも相同性がなく,(3)更に,既報のCPに例外なく,保存されている活性中心アミノ酸配列もないなど極めて特徴の高いCPである。
1.触媒残基の同定(チロスタチンを応用して)
著者の分取したチロスタチン(N-Isovaleryl-Tyrosyl-Leucyl-Tyrosinal)をモデルとして,アフィニティラベル試薬を4種類合成し,そのうちの1つ,N-benzyloxycarbonyl-L-Phenylalanine-2,3-epoxypropyl esterが有効であることを認めた。現在,この試薬を使用して,触媒残基を同定中であり,数カ月後には決定の予定。
2.高発現系の確立
本酵素はアミノ酸587残基のプレプロ体として生合成され,プロセッシングを受けて,372アミノ酸残基の成熟型CPとして細胞外に分泌される。今回,この組替え体酵素の高発現系の構築について種々検討した。また,プロ領域(〜215アミノ酸残基)は,成熟型酵素の活性化に関与していると推察した。
3.触媒残基の同定(部位特異的改変体を使用して)
1.で触媒残基の候補として絞られたアミノ酸残基について,部位特異的改変体を作成し,野生型CPと改変体を反応速度論的に比較検討することにより,触媒残基の確定を行う予定であったが,触媒残基の同定に至っていないので本項目の実験は今後の課題である。
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