| 研究課題/領域番号 |
04670150
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
医化学一般
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| 研究機関 | 札幌医科大学 |
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研究代表者 |
佐々木 輝捷 札幌医科大学, 医学部・付属癌研究所 (00045494)
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| 研究分担者 |
名倉 和子 札幌医科大学, 医学部・付属癌研究所, 技師
石埜 正穂 札幌医科大学, 医学部・付属癌研究所, 助手 (30232325)
佐々木 洋子 札幌医科大学, 医学部・付属癌研究所, 講師 (60045424)
山下 由美 札幌医科大学, 附属癌研究所, 技師
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| 研究期間 (年度) |
1992 – 1993
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| 研究課題ステータス |
完了 (1993年度)
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| 配分額 *注記 |
2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
1993年度: 500千円 (直接経費: 500千円)
1992年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
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| キーワード | Src相同領域3 / タンパク質チロシンキナーゼ / チロシンリン酸化 / GST融合タンパク質 / Fyn / ダブルチロシンモチーフ / cDNA発現クローニング / T細胞受容体 / CD3複合体 / B細胞抗原受容体 / バキュロウィルス発現系 |
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| 研究概要 |
1.Src相同領域3(SH3)は、タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)の活性化によるシグナル伝達において、シグナル伝達・変換タンパク質の分子会合を仲介する。Fyn・PTKのSH3に結合する新しいリガンドタンパク質に対するcDNAをクローン化した。クローン化cDNAは、FynのSH3領域をプローベとして用い、マウス胎児のcDNA発現ライブラリーをスクリーニングすることにより得た。このタンパク質は、成体でも脳において重ね継ぎ変異体が発現されている。この新しいタンパク質は、FynおよびSrcのSH3と特異的に結合するプロリンの多い配列を2個有し、また同時に、新しいSH3領域、更に、SH2領域に対するリガンド構造を有していた。このタンパク質に対する特異抗体を調整し、奇型腫細胞株およびcDNAを導入。発現したCOS-7細胞からこのタンパク質を免疫沈降し、イムノブロットにより固定した。COS-7細胞でFynを共発現すると、このFynによりクローン化タンパク質はチロシンリン酸化された。2.FynのSH3領域のGST融合タンパク質を固相化したアフィニティーカラムを用い、培養jurkat細胞抽出液から、FynSH3領域に特異的に結合する70kDaのタンパク質を固定した。この70kDaタンパク質をSDS-PAGEゲルから抽出後、トリプシン消化し、得られたペプチドを逆相HPLCで分離した。各ピークのアミノ酸配列を気相シークエンサーで分析した結果、GAP結合性リン酸化タンパク質p62であることが示唆された。SH3領域はプロリンを多く含む配列に結合することが知られている。p62の配列中に複数見出されるプロリンに富む配列をそれぞれGST融合タンパク質として発現させ、一連のSH31GST融合タンパク質との結合を調べた所、p62の各配列がSH3の異なったサブセットとそれぞれ特異的に結合することが見出された。
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