| 研究課題/領域番号 |
04670511
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
循環器内科学
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
保嶋 実 東北大学, 医学部, 助教授 (90142934)
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| 研究分担者 |
上月 正博 東北大学, 医学部・附属病院, 助手 (70234698)
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| 研究期間 (年度) |
1992 – 1993
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| 研究課題ステータス |
完了 (1993年度)
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| 配分額 *注記 |
2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
1993年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
1992年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
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| キーワード | neutral metalloendopeptidase / NEP阻害薬 / 標識NEP阻害薬 / radioinhibitory binding assay / in vitro autoradiography / ラット腎 / neutral metalloendopeptidase(NEP) |
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| 研究概要 |
(1)メタノール濃度勾配法を用いて、NEP阻害薬SCH47896を^<125>Iで標識することに成功した。SCH47896と^<125>IをIodogenでコーディングしたバイアル内で反応させた。次に、反応液をSep-pak C18カートリッジを用いて、trifluoroacetic acid、メタノール溶液(濃度勾配40-100%)で溶出させ、フラクションコレクターを用いて[^<125>I]SCH47896を採取した。
(2)標識NEP阻害薬を用いたradioinhibitory binding assay法の開発に成功した。ラットの腎ホモジェネートから遠心分離した形質膜分画を[^<125>I]SCH47896と反応させ、[^<125>I]SCH47896が結合した膜分画を遠心分離し、その放射活性をガンマーカウンターで測定した。また、種々のNEP阻害薬、EDTA、enalaprilatによる結合阻害曲線を求め、そのパターンを解析し、結合の様式、定数、数、特異性を検討した。以上より、[^<125>I]SCH47896は、NEPの活性部位へ特異的に結合し、その結合はsingle site modelに合致し、Kd値は43.3nM、最大結合能は13.8pmol/mg蛋白であった。
(3)標識NEP阻害薬を用いたin vitro autoradiography systemの開発に成功した。ラット腎をイソペンタン(-40℃)で凍結させ、cryostatで連続切片(20μm厚)を作製した。乾燥操作後、[^<125>I]SCH47896溶液に浸し、20℃で60分間反応させた。洗浄し、乾燥操作後、X線フィルムに室温で1〜3日間露出させた。フィルムを現像し、結合の密度、分布、様式をコンピューター解析した。以上より、[^<125>I]SCH47896の結合は、主に深在近位尿細管に認められ、ANPはNEPにより、主に深在の近位尿細管で分解されることが示唆された。
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