| 研究課題/領域番号 |
04670532
|
|---|
| 研究種目 |
一般研究(C)
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 研究分野 |
循環器内科学
|
|---|
| 研究機関 | 京都大学 |
|---|
研究代表者 |
由井 芳樹 京都大学, 医学部, 助手 (20158330)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
1992
|
| 研究課題ステータス |
完了 (1992年度)
|
| 配分額 *注記 |
2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
1992年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
|
|---|
| キーワード | EDRF / NO / 血管 / 弛緩 / 内皮細胞 / cDNA / クローニング / NO合成酵素 |
|---|
| 研究概要 |
ラット腹腔の活性化マクロファージからNO合成酵素の誘導型の蛋白を均一に精製した。この蛋白質をリシルエンドペプチダーゼAP-Iで分解処理しペプチドを逆相HPLCで分離、分取した。
ペプチドを473A(AB社)ペプチドシーケンサーで解析し各ペプチドのアミノ酸配列を決定しデータベースでホモロジー検索を行ったが既知のペプチドとのホモロジーはなかった。
上記のペプチドに対するDNAプローブをDNA合成した。
活性化マクロファージからCaCl法によりRNAを作成し更にmRNAを精製した。このmRNAからoligo dTをプライマーとしてcDNAをつくりλgt10でcDNAライブラリーを作成した。
PCR法により先の合成DNAから300-500bpsのDNAを合成しランダムブリング法により^<32>Pラベルした。
このラベルしたDNAをプローブにしてcDNAライブラリーからスクリーニングし陽性クローンを得た。
さらに他のプローブを用いてスクリーニングし最終的に1クローンを得た。M13にこのクローンをサブクローンしcDNA塩基配列を決定した。次にこのcDNAを発現ベクターPC DM8に組み込みCOS7細胞にtransfectionし本酵素の発現を検討した。
COS7細胞を破壊後本酵素活性を測定すると酵素活性が測定できた。
次にこの酵素の制御を検討した結果Ca^<++>は必要であったがcalmodulinは必要としなかった。
|
